Striatin-gene loss of function induces functional alterations in a haploid stem cell mouse model for cardiomyogenic differentiation

Abstract

Background Striatin (Strn) is a ubiquitous Ca2+-dependent scaffolding protein that in cardiomyocytes (CMs) co-localizes at the intercalated disc region with desmosomal proteins. Recent studies demonstrated that a deletion in the 3’ untranslated region of the STRN gene was associated with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy in dogs. Moreover, the Striatin gene was also recently associated with cardiac abnormalities in Drosophila melanogaster. Mouse embryonic stem cells (mESCs) with a haploid chromosomal set have recently been suggested as a good tool for genetic screens. They retain the capacity to differentiate into the three germ layers in vitro and, possessing just one copy of each gene, they facilitate the generation of loss-of-function mutants that represent a powerful tool to investigate the role of new target genes. Preliminary evidence obtained in our laboratory indicates that Strn knock out could impact the electrophysiological properties of haploid mESC-derived cardiomyocytes (CMs). Objectives This thesis tries to elucidate how the Strn cellular depletion affects the functional characteristics of haploid mESC-derived CMs. To this aim, a Strn-mutant line of haploid mESC line (namely 377C05) generated by gene trapping by J. Penninger and co-workers was used. This mutant and the corresponding wild-type (WT) line were used as cell models for this project. Methods The differentiation protocol based on the hanging drop technique was modified to optimize the appearance of beating embryoid bodies (EBs) from haploid mESCs. The cardiomyogenic differentiation process was evaluated at the functional, morphological and molecular level in the Strn-mutants and compared to WTs. Specifically, the contractility properties of the beating areas were assessed by video tracking analysis, spontaneous action potentials (APs) were recorded by current clamp, and intracellular calcium concentration was simultaneously monitored in Fluo-4 loaded EBs. Structural changes of haploid mESC-derived CMs immunostained for Troponin-T were evaluated by confocal microscope, while changes in the expression of pluripotency genes, cardiac differentiation markers, Strn interacting proteins and ion channels were estimated by quantitative Real time-PCR. All the data were analyzed using non-parametric statistical tests. Results At day 12 of differentiation, we found a significant decrease in the number and the dimension of beating areas in Strn-mutant as compared with WT, together with a significant lower frequency of contraction and a dysregulated (arrhythmic) contraction behavior. However, when the frequency of APs was evaluated, it appeared higher in Strn-mutant. Furthermore, the AP duration was decreased, as well as the duration of the diastolic depolarization phase, possibly suggesting an alteration in the EC-coupling process. Thus, the calcium-induced calcium release process was investigated by simultaneous recordings of spontaneous APs and their induced calcium transients. Intriguingly, no differences were observed: in fact, every AP was aligned with a calcium spike. However, when we evaluated the delay between each AP peak and its correspondent calcium peak, we observed a trend of increased delay in the mutants versus WTs. In addition, the amount of Ca2+ released after spontaneous APs in the mutant was about twice lower than in the WTs. Further, the sarcomere structure analysis showed that 49% of CMs, obtained from Strn-mutant, presented sarcomeres with an absence of the striated configuration for Troponin-T. When gene expression was investigated, we found a significant upregulation of β-catenin and HCN4 expression in Strn-mutants. Conclusions Here we provide evidence that Strn-mutants are characterized by: (i) alteration in APs frequency and action potential duration, (ii) reduced contraction frequency and beating area dimension, (iii) delayed Ca2+ release (iv) reduced amplitude of Ca2+ transients and (v) structural alteration of the sarcomere. Overall, these results indicate that Strn has a strong impact on CMs function, possibly representing a new molecular target for the identification of new causes and therapies of cardiovascular disease.

Introduzione: Striatina (Strn) è una proteina scaffold, in grado cioè di mediare l’interazione fra proteine diverse permettendone la corretta funzione. È una proteina ubiquitaria calcio-dipendente che, nei cardiomiociti (CMs) si localizza nei dischi intercalari con le proteine desmosomiali. Studi recenti hanno dimostrato come una delezione nella regione 3' non tradotta del gene di STRN nei cani è associata sia alla cardiomiopatia aritmogena sia alla cardiomiopatia dilatativa. Infine, il gene codificante per Striatina è stato recentemente associato ad alterazioni cardiache in Drosophila Melanogaster. Le cellule staminali embrionali murine (mESCs) con un set cromosomico aploide sono state recentemente considerate come un buon modello per screening genetici. Esse mantengono la capacità di differenziare in vitro nei tre foglietti embrionali e, possedendo solo una copia di ogni gene, facilitano la creazione di mutanti con perdita di funzione (knock-out) che rappresentano un potente strumento per studiare il ruolo di nuovi geni bersaglio. Evidenze preliminari ottenute nel nostro laboratorio indicano come la rimozione dell’espressione di Striatina possa influenzare le proprietà elettrofisiologiche dei CMs ottenuti da mESCs aploidi. Obiettivi: Scopo del presente lavoro è stato chiarire come la mancanza di Strn abbia conseguenze sulle caratteristiche funzionali dei CMs ottenuti dalle mESCs aploidi. A questo scopo, è stata utilizzata una linea di cellule mESCs aploidi mutanti per Strn, chiamata 377C05 e prodotta da J. Penninger e collaboratori tramite ‘gene trapping’. Tale linea mutante e la rispettiva linea controllo (WT) sono state utilizzate come un modello cellulare per questo progetto. Metodi: Il classico protocollo di differenziamento basato sulla “goccia pendente” è stato modificato per ottimizzare la comparsa di corpi embrioidi (EBs) battenti dalle mESCs aploidi. Il processo di differenziamento cardiomiogenico è stato valutato a livello funzionale, morfologico e molecolare nel mutante di Strn e confrontato con il WT. In particolare, le capacità contrattili delle aree battenti sono state valutate mediante analisi di video tracking, i potenziali di azione (APs) sono stati registrati tramite current-clamp, e la concentrazione di calcio intracellulare è stata contemporaneamente registrata grazie all’utilizzo del colorante calcio dipendente Fluo-4. Infine, i cambiamenti a livello dell’organizzazione sarcomerica sono stati valutati mediante analisi confocale sui CMs ottenuti dalle mESCs aploidi utilizzando un anticorpo per la Troponina-T, mentre variazioni nell´espressione dei geni di pluripotenza, dei marcatori della differenziazione cardiaca, dei canali ionici e di alcune proteine che interagiscono con Strn sono stati saggiati mediante Real time-PCR quantitativa. Tutti i dati sono stati esaminati usando test statistici non parametrici. Risultati: Al giorno 12 di differenziazione, nel mutante per Strn sono state riscontrate differenze significative rispetto al WT nel numero e nelle dimensioni delle aree battenti, insieme ad una frequenza di contrazione più bassa e un andamento irregolare della contrazione (aritmia). Tuttavia, la frequenza degli APs spontanei risultava più alta nei mutanti. Inoltre, la durata degli APs era minore, così come la durata della fase di depolarizzazione diastolica, suggerendo un´alterazione a livello del processo di eccito-contrazione. Si è pertanto deciso di indagare la dinamica del calcio (Calcium-induced calcium release) intracellulare attraverso registrazioni simultanee dei APs spontanei e dei transienti di calcio da essi indotti. Curiosamente, nessuna differenza è stata osservata: infatti ogni APs era allineato con un picco di calcio. Sebbene quando si è valutato il tempo tra ogni picco di APs e il corrispondente picco di calcio, è stato osservato un trend di aumento del ritardo nel rilascio di calcio nel mutante rispetto al controllo. Inoltre, la quantità di Ca2+ rilasciato dopo ogni AP spontaneo, nel mutante era circa due volte minore rispetto al WT. Infine, l'analisi della struttura sarcomerica ha mostrato che il 49% di CMs, ottenuto dal mutante per Strn, non presentava nei sarcomeri la tipica configurazione striata della troponina-T. Infine nella linea mutante, si è riscontrato un aumento statisticamente significativo per l´espressione dell´mRNA della β-catenina e del canale HCN4. Conclusioni: I nostri dati mostrano che i mutanti per Strn sono caratterizzati da: (i) alterazione della frequenza e nella durata degli APs, (ii) riduzione nella frequenza di contrazione e nella dimensione delle aree battenti, (iii) ritardo del picco del transiente di calcio rispetto al picco dell’AP corrispondente, (iv), ridotta ampiezza dei transienti di Ca2+ rilasciato dopo ogni AP spontaneo e (v) alterazione strutturali dei sarcomeri. Nel complesso, questi risultati indicano che Strn ha un forte impatto sulla funzione dei cardiomiociti, suggerendo Strn come un nuovo possibile bersaglio molecolare nell’individuazione di cause e possibili cure delle patologie cardiovascolari.