Thermodynamics of the interaction between biologically active molecules and substrates of pharmaceutical interest

Abstract

La prima parte del presente progetto di ricerca è rivolta alla progettazione ed alla caratterizzazione chimico-fisica e strutturale di nuove molecole biologicamente attive, principalmente tensioattivi gemini cationici. Ne è stata valutata l’attività biologica e la potenzialità come vettori in terapia genica. Sono stati studiati in funzione della lunghezza dello spaziatore, n (n = 3, 4, 8, 12) i tensioattivi gemini bispiridinici cationici idrogenati, con differenti catene idrofobiche. Lo stesso è stato fatto per i composti con catene a 8 atomi di carbonio, di cui gli ultimi sei fluorurati. Infatti, si ritiene che i lipidi cationici fluorurati possano costituire una valida opzione per ottenere una efficiente espressione genica in fluidi biologici contenenti surfattanti idrogenati, per esempio quando i geni di interesse devono essere veicolati all’epitelio respiratorio o biliare. La loro attività trasfettiva e la struttura delle nanoparticelle di DNA, come studiato tramite AFM, sono strettamente correlate alla struttura che assumono in soluzione, che dipende dalla lunghezza dello spaziatore, come evidenziato dall’andamento delle curve delle entalpie molari e parziali in funzione della molalità. Per quanto riguarda i surfattanti gemini idrogenati, il composto con spaziatore di quattro atomi di carbonio e, per i surfattanti fluorurati, quello con spaziatore a otto atomi di carbonio, che presentano inaspettate proprietà entalpiche in funzione della concentrazione, mostrano una attività trasfettiva confrontabile con quella del reagente commerciale di riferimento quando co-formulati con DOPE. Si ipotizza che questi composti agiscano come pinze molecolari in grado di interagire con basi di DNA vicine. La parziale fluorurazione delle catene idrofobiche richiede una maggiore lunghezza dello spaziatore per il folding della molecola in confronto agli analoghi idrogenati. Ciò è dovuto al maggiore ingombro sterico ed alla rigidità della parte fluorurata e alla repulsione tra le catene idrogenate e fluorurate lipofobiche. I composti con spaziatore più lungo, sia idrogenati che fluorurati, danno luogo a strutture scarsamente condensate formando come dei fiocchi, incapaci di dar luogo a trasfezione. Il confronto tra composti fluorurati ed idrogenati rivela la maggiore capacità dei composti fluorurati nel compattare il DNA. Gli studi di termodinamica in soluzione, riportati in letteratura per la prima volta per queste classi di composti, rappresentano una sonda sensibile del comportamento delle molecole in soluzione, rendendo i “vecchi” metodi molto utili per poter comprendere a livello molecolare le “nuove” applicazioni. La seconda parte della tesi è focalizzata sulla progettazione e sulla valutazione chimica e biologica di alcune molecole contenenti un motivo chelante in grado di legare uno o due ioni metallici presenti nel sito attivo di alcuni enzimi virali, inibendo la replicazione virale. Tramite studi potenziometrici sono state ottenute le specie formate in soluzione e le relative costanti di formazione di nuovi leganti contenenti una porzione 2-idrossiamidica e acilidrazonica con Mg(II) e Cu(II) in modo da far luce sul loro meccanismo d’azione. Le salicilamidi ed i loro complessi con Mg(II), studiati per le loro interessanti proprietà biologiche da lungo tempo, mostrano attività in vitro nei confronti del virus dell’influenza. I risultati degli studi potenziometrici e le analisi di modeling molecolare suggeriscono che la loro attività può essere dovuta alla possibilità di chelazione degli ioni Mg(II) presenti nel sito attivo dell’endonucleasi del virus dell’influenza.

The first part of the research project is devoted to the design, chemico-physical, and structural characterisation of newly synthesised biologically active molecules, mainly gemini cationic surfactants. Their biological activity and their potentiality as vectors in gene therapy has been evaluated. Hydrogenated bispyridinium cationic gemini surfactants differing in hydrophobic chain length have been studied as a function of the spacer length, n (n = 3, 4, 8, 12). The same has been done for compounds with 8 carbon atoms in the alkyl chains, the last six fluorinated. In fact, it is accepted that fluorinated cationic lipids could be a sound option for efficient gene expression in biological fluids containing hydrogenated interfering surfactants, e.g. when genes have to be delivered to the respiratory or to the biliar epithelium. Their transfection activity and the structure of the DNA nanoparticles, as studied by AFM, are strictly related to their structure in solution, dependent on the spacer length and highlighted by the trends of the apparent and partial molar enthalpies vs. molality. For the hydrogenated gemini surfactants, the compound with spacer formed by four carbon atoms, and, for the highly fluorinated ones, the compound with spacer formed by eight carbon atoms, both showing unexpected enthalpic properties vs. concentration, gives rise to a transfection activity comparable to that of the commercial reagent, when formulated with DOPE. We suggest that these compounds behave like molecular tongs able to grip basic group near each other. The partial fluorination of the hydrophobic chains requires a greater length of the spacer for the folding of the molecule compared to the hydrogenated analogues. The reason lies both in the greater steric hindrance and rigidity of the fluorinated moiety, and in the repulsion between the hydrogenated and the fluorinated lipophobic tails. The compounds with the longest spacer, both hydrogenated and fluorinated, give rise to loosely condensed structure by forming a sort of bows, not able to give rise to transfection. The comparison between hydrogenated and fluorinated compounds, reveals a greater ability of the partially fluorinated ones to compact DNA. Solution thermodynamic studies, reported in the literature for the first time about this class of compounds, result in a very sensitive probe of the behavior of the molecule in solution, making “old” methods very useful for understanding “new” applications at molecular level. The second part is focused on the design and on the chemical and biological evaluation of some scaffolds containing a chelating motif able to bind one or two metal ions in the active site of some viral enzymes, so inhibiting viral replication. The species formed in solution and the formation constants of new ligands containing 2-hydroxyamide- and acylhydrazone-based scaffolds with Mg(II) and Cu(II) have been obtained by potentiometry in order to shed light on their mechanism of action. Salycilamides and their Mg(II) complexes, studied for their interesting biological properties for a long time, show in vitro activities against influenza virus. The results of the potentiometric studies and the molecular modeling analysis suggest that their activity can be due to the possibility to chelate the Mg(II) ions in the active site of influenza virus endonuclease.