Investigation of healthy and infected newborn saliva: the role of proteins and lipids as potential inflammatory diagnostic tools

Abstract

We have carried out a discovery proteomics investigation aimed at identifying disease biomarkers present in saliva, and, more specifically, early biomarkers of inflammation. The proteomic characterization of saliva is possible due to the straightforward and non-invasive sample collection that allows repetitive analyses for pharmacokinetic studies. These advantages are particularly relevant in the case of newborn patients. The study was carried out with samples collected during the first 48 hours of life of the newborns according to an approved Ethic Committee procedure. In particular, the salivary samples were collected from healthy and infected (n=1) newborns. Proteins were extracted through cycles of sonication, precipitated in ice cold acetone, resuspended and resolved by 2D-electrophoresis. MALDI TOF/TOF mass spectrometry analysis was performed for each spot obtaining the proteins’ identifications. Then we compared healthy newborn salivary proteome and an infected newborn salivary proteome in order to investigate proteins differently expressed in inflammatory condition. In particular the protein alpha-1-antitrypsin (A1AT), correlated with inflammation, was detected differently expressed in the infected newborn saliva. Therefore, in the second part of the project we aimed to develop a robust LC-MS based method that identifies and quantifies this inflammatory protein within saliva that might represent the first relevant step to diagnose a condition of inflammation with a no-invasive assay. The same LC-MS method is also useful to investigate the presence of the F allelic variant of the A1AT in biological samples, which is correlated with the onset of pulmonary diseases. In the last part of the work we analysed newborn saliva samples in order to investigate how phospholipids and mediators of inflammation (eicosanoids) are subject to variations under inflammatory conditions and a trend was observed in lysophosphatidylcholines composition according to the inflammatory conditions.

Abbiamo svolto un'indagine proteomica volta ad individuare biomarker di infiammazione presenti nella saliva e, più in particolare, i biomarker dei primi stadi di infiammazione. La caratterizzazione proteica della saliva è possibile grazie alla semplice e non invasiva raccolta del campione, che permette analisi ripetitive per studi farmacocinetici. Questi vantaggi sono particolarmente rilevanti nel caso di pazienti neonati. In particolare, lo studio è stato effettuato con campioni raccolti durante le prime 48 ore di vita dei neonati mediante una procedura approvata da un comitato etico. I campioni di saliva sono stati raccolti da neonati sani e infetti. Le proteine sono state estratte attraverso cicli di sonicazione, precipitate a freddo con acetone, risospese ed analizzate con la tecnica della 2D-elettroforesi. L’analisi di spettrometria di massa MALDI TOF / TOF è stata effettuata per ogni spot ottenendo l’identificazione delle proteine. Successivamente abbiamo confrontato il proteoma di neonato sano con quello di neonato infetto al fine di indagare le proteine differentemente espresse in condizione infiammatoria. In particolare, la proteina alfa-1-antitripsina (A1AT), correlata con l'infiammazione, è stata rilevata espressa in modo diverso nella saliva di neonato infetto. Pertanto, nella seconda parte del progetto abbiamo sviluppato un robusto metodo basato sull’LC-MS per identificare e quantificare questa proteina infiammatoria all'interno saliva, che potrebbe rappresentare il primo rilevante passo per diagnosticare una condizione di infiammazione nei neonati, con un saggio non invasivo. Lo stesso metodo LC-MS è anche utile per indagare la presenza della variante allelica F della A1AT in campioni biologici, che è correlato con l'insorgenza di malattie polmonari. Nell'ultima parte del lavoro abbiamo analizzato campioni di saliva di neonati al fine di indagare come fosfolipidi e mediatori dell'infiammazione (eicosanoidi) sono soggetti a variazioni in condizioni infiammatorie e una trend è stato osservato per le lisofosfatidilcoline in condizioni infiammatorie.