Reformulation of a thermostable broadly protective recombinant vaccine against human papilloma virus

Abstract

The causal relationship between Human Papilloma Virus (HPV) infection and cervical cancer has motivated the development, and further improvement, of prophylactic vaccines against this virus. 70% of cervical cancers, 80% of which in low-resources countries, are associated to HPV16 and HPV18 infection, with 13 additional HPV types, classified as high-risk, responsible for the remaining 30% of tumors. Current vaccines, Cervarix® (GlaxoSmithKline) and Gardasil®(Merk), are based on virus-like particles (VLP) obtained by self-assembly of the major capsid protein L1. Despite their undisputable immunogenicity and safety, the fact that protection afforded by these vaccines is largely limited to the cognate serotypes included in the vaccine (HPV 16 and 18, plus five additional viral types incorporated into a newly licensed nonavalent vaccine) along with high production costs and reduced thermal stability, are pushing the development of 2nd generation HPV vaccines based on minor capsid protein L2. The increase in protection broadness afforded by the use of L2 cross-neutralizing epitopes, plus a marked reduction of production costs due to bacterial expression of the antigens and a considerable increase in thermal stability could strongly enhance vaccine distribution and usage in low-resource countries. Previous studies from our group identified three tandem repeats of the L2 aa. 20-38 peptide as a strongly immunogenic epitope if exposed on the scaffold protein thioredoxin (Trx). The aim of this thesis work is the improvement of the Trx-L2 vaccine formulation with regard to cross-protection and thermostability, in order to identify an antigen suitable for a phase I clinical trial. By testing Trx from different microorganisms, we selected P. furiosus thioredoxin (PfTrx) as the optimal scaffold because of its sustained peptide epitope constraining capacity and striking thermal stability (24 hours at 100°C). Alternative production systems, such as secretory Trx-L2 expression in the yeast P. pastoris, have also been set-up and evaluated as possible means to further increase production yields, with a concomitant reduction of production costs. Limitations in immune-responsiveness caused by MHC class II polymorphisms –as observed, for example, in different mouse strains- have been overcome by introducing promiscuous T-helper (Th) epitopes, e.g., PADRE (Pan DR Epitope), at both ends of PfTrx. This allowed us to obtain fairly strong immune responses even in mice (C57BL/6) normally unresponsive to the basic Trx-L2 vaccine. Cross-protection was not increased, however. I thus designed, produced and tested a novel multi-epitope formulation consisting of 8 and 11 L2(20-38) epitopes derived from different HPV types, tandemly joined into a single thioredoxin molecule (“concatemers”). To try to further increase immunogenicity, I also fused our 8X and 11X PfTrx-L2 concatemers to the N-terminus of an engineered complement-binding protein (C4bp), capable to spontaneously assemble into ordered hepatmeric structures, previously validated as a molecular adjuvant. Fusion to C4bp indeed improved antigen presentation, with a fairly significant increase in both immunogenicity and cross-protection. Another important issue I addressed, is the reduction of vaccine doses/treatment, which can be achieved by increasing immunogenicity, while also allowing for a delayed release of the antigen. I obtained preliminary, yet quite encouraging results in this direction with the use of a novel, solid-phase vaccine formulation, consisting of the basic PfTrx-L2 vaccine and its C4bp fusion derivative adsorbed to mesoporus silica-rods (MSR).

La determinazione della correlazione tra infezione da Papillomavirus (Human Papillomavirus, HPV) e carcinoma cervicale, è stata cruciale per lo sviluppo di strategie profilattiche vaccinali atte alla prevenzione del tumore. Nonostante siano stati classificati 15 sierotipi ad alto rischio, il 70% dei tumori è associato all’ infezione da parte di HPV16 e HPV18, la cui incidenza aumenta notevolmente nei paesi in via di sviluppo, dove i trattamenti sanitari sono insufficienti. I vaccini commerciali ad oggi esistenti, Cervarix® (GlaxoSmithKline) e Gardasil® (Merk), sono basati sulle virus like particles (VLP) ottenute mediante self-assemblaggio della proteina capsidica maggiore L1. Nonostante l’elevata immunogenicità e sicurezza, la limitata protezione ai soli sierotipi inclusi nelle formulazioni (HPV 16 and 18, più 5 sierotipi addizionali incorporati nell’ ultimo vaccino approvato nonavalente), unita all’elevato costo di produzione, ha spinto la ricerca verso strategie vaccinali di seconda generazione basati sulla proteina capsidica minore L2. L’aumento dello spettro di protezione ottenuto dall’uso di epitopi L2 cross-neutralizzanti, unito ad una riduzione dei costi di produzione, grazie alla possibilità di espressione in batterio, e all’aumento della stabilità termica, possono fortemente incrementare la distribuzione del vaccino nel paesi in via di sviluppo. Studi precedenti del nostro gruppo hanno identificato il tripeptide L2 20-38 come l’epitopo maggiormente immunogenico se inserito in uno scaffold proteico quale la tioredossina (Trx). Scopo di questa tesi è il miglioramento della formulazione vaccinica Trx-L2 sia in termini di termostabilità che di cross-protezione con l’intento di identificare un antigene da proporre per un trial clinico di fase I. Sottoponendo Trx, derivanti da diversi organismi, a studi di termostabilità, è stato possibile selezionare la Trx di P. furiosus (PfTrx) come scaffold ottimale grazie alla sua elevata stabilità termica (100°C per 24h) e il maggiore constraining strutturale. L’uso del sistema di produzione basato sulla secrezione nel lievito P. pastoris, progettato e investigato in questa tesi, si è dimostrato un’ alternativa valida per aumentare la produzione antigenica con una concomitante riduzione dei costi di produzione. Le limitazioni tra diverse specie dovute all’elevato polimorfismo delle MHC di classe II, sono state superate inserendo epitopi T helper (Th) promiscui, in particolare PADRE (Pan DR Epitope), ad entrambe le estremità della PfTrx. Questo permette di stimolare una forte risposta immunitaria anche in topi (C57BL/6) normalmente non responsivi alla formulazione vaccinica di base Trx-L2 . Se questi epitopi Th permettono di superare i polimorfismi di specie, non consentono però un aumento dello spettro di protezione. A questo scopo, ho progettato, prodotto e testato una nuova formulazione formata da 8 e 11 epitopi L2(20-38) derivati da diversi sierotipi HPV, fusi insieme in una singola molecole all’interno della Trx (“concatenameri”). Per incrementare ulteriormente la risposta immunitaria, ho fuso all’N-terminale dei concatenameri 8X e 11X PfTrx-L2, il dominio ingegnerizzato di oligomerizzazione della complement-binding protein (C4bp), in grado di assemblarsi spontaneamente in una struttura eptamerica, precedentemente valida come adiuvante molecolare. La fusione con C4bp permette un aumentata presentazione antigenica con conseguente incremento dell’immunogenicità e della cross-protezione. Un altro importante aspetto affrontato è la riduzione del numero di somministrazioni, che può essere ottenuto aumentando l’immunogenicità insieme ad rilascio graduale dell’antigene. Dati preliminari incoraggianti sono stati ottenuti con l’uso di nuova formulazione su fase solida, basata sul vaccino di base PfTrx-L2 e la corrispondente versione fusa al C4bp, adsorbite a microparticelle mesoporose di silice (MSR).