Isolation, characterization and discovery of new alleles of sHsp genes in durum wheat (Triticum durum Desf.)

Abstract

Gli organismi vegetali mostrano una notevole capacità di adattamento alle condizioni di stress e lo studio delle componenti molecolari alla base dell'adattamento in colture cerealicole di interesse alimentare, come il frumento, è di particolare interesse per lo studio di varietà che consentano una buona produzione con basso input anche in condizioni ambientali non ottimali. L'esposizione delle colture cerealicole a stress termico durante determinate fasi del ciclo vitale influisce negativamente sulla resa e sulla qualità, a questo fine è necessario chiarire le basi genetiche e molecolari della termotolleranza per identificare geni e alleli vantaggiosi da impiegare in programmi di incrocio volti al miglioramento genetico. Numerosi studi dimostrano il coinvolgimento delle sHSP a localizzazione cloroplastica (in frumento sHSP26) nel meccanismo di acquisizione della termotolleranza e la loro interazione con diverse componenti del fotosistema II (PSII) che determinerebbe un’azione protettiva in condizioni di stress termico e altri tipi di stress. Lo scopo del progetto è quello di caratterizzare in frumento duro nuove varianti alleliche correlate alla tolleranza a stress termico mediate l'utilizzo del TILLING (Target Induced Local Lesion In Genome), un approccio di genetica inversa che prevede la mutagenesi e l'identificazione delle mutazioni indotte in siti di interesse. Durante la tesi sono state isolate e caratterizzate 3 sequenze geniche complete per smallHsp26 denominate TdHsp26-A1; TdHsp26-A2; TdHsp26-B1 e un putativo pseudogene denominato TdHsp26-A3. I geni isolati sono stati usati come target in analisi di TILLING in due popolazioni di frumento duro mutagenizzate con EMS (EtilMetanoSulfonato). Nel nostro studio sono stati impiegati due differenti approcci di TILLING: un approccio di TILLING classico mediante screening con High Resolution Melting (HRM) e un approccio innovativo che sfrutta un database di TILLING recentemente sviluppato. La popolazione di mutanti cv. Kronos è stata analizzata per la presenza di mutazioni in tutti e tre i geni individuati mediante ricerca online nel database di TILLING, il quale sfrutta la tecnica dell’exome capture sulla popolazione di TILLING seguito da sequenziamento ad alta processività. Attraverso questa tecnica sono state individuate, nella popolazione mutagenizzata di frumento duro cv. Kronos, 36 linee recanti mutazioni missenso. Contemporaneamente lo screening con HRM, effettuato su 960 genotipi della libreria di TILLING di frumento duro cv. Cham1 ha consentito di individuare mutazioni in una regione di 211bp di interesse funzionale del gene TdHsp26-B1, tra le quali 3 linee mutanti recanti mutazioni missenso in omozigosi. Alcune mutazioni missenso individuate sui due geni TdHsp26-A1 e TdHsp26-B1 sono state confermate in vivo nelle piante delle rispettive linee mutanti generando marcatori codominanti KASP (Kompetitive Allele Specific PCR) con cui è stato possibile verificare anche il grado di zigosità di tali mutazioni. Al fine di ridurre il numero di mutazioni non desiderate nelle linee risultate più interessanti, è stato eseguito il re-incrocio dei mutanti con i relativi parentali wild type ed inoltre sono stati generati alcuni doppi mutanti che consentiranno di comprendere meglio i meccanismi molecolari presieduti da questa classe genica. Gli individui F1 degli incroci sono stati poi genotipizzati con i medesimi marcatori KASP specifici per la mutazione di interesse per verificare la buona riuscita dell’incrocio. Questo approccio ha permesso di individuare ed implementare risorse genetiche utili ad intraprendere studi funzionali relativi al ruolo di smallHSP plastidiche implicate nella acquisizione di termotolleranza in frumento duro e di generare marcatori potenzialmente utili in futuri programmi di breeding.

Plants show high adaptability to the environment also in stress conditions; study the molecular basis of adaptability in a crop plants as wheat is of particular interest due to its important role as staple food. Moreover climate changes are predicted to have severe negative effects on wheat production over the next decades. Wheat is between the top five cultivated crops in the world and durum wheat (Triticum durum Desf.), in particular, is cultivated in more than 40 countries with a production of about 37 Mtons. The exposure to heat stress during wheat developmental stages negatively affect yield and quality, therefore the current challenge of basic and applied research is to decipher the molecular mechanisms that take place during the adaptation to heat stress to produce new genetic variability to employ in wheat breeding programs. Small heat shock proteins (sHSPs) are chaperone-like proteins that play an important role in the prevention of irreversible aggregation of misfolded protein. The chloroplast sHSPs are known to have an important role in the thermotolerance acquisition protecting the Photosystem II and thylakoid membranes during heat stress. Three complete durum wheat gene sequence coding for chloroplast-localized sHSPs named TdHsp26-A1, TdHsp26-A2, TdHsp26-B1 and a putative pseudogene sequence named TdHsp26-A3, members of the chloroplast sHSP sub-family, have been isolated and characterized. Novel allelic variations in the target genes were detected combining a conventional TILLING approach (HRM detection) with a new online TILLING database search. The search of the TILLING database, based on the exome captured sequencing of the durum wheat cv. Kronos TILLING population, leads to the detection of 36 mutant lines carrying missense mutations spanning the entire coding sequence of TdHsp26-A1, TdHsp26-A2 and TdHsp26-B1 genes. Moreover the conventional HRM screening of 960 genotypes of the durum wheat cv. Cham1 TILLING population leads to the detection of 3 missense mutations within a functional interest region of the TdHsp26-B1. The more interesting SNP mutations inducing non-synonymous substitutions in functional domains of the TdHSP26-A1 and TdHSP26-B1, were confirmed in vivo through the development of specific codominant KASP molecular markers. During this thesis new genetic variability in genes coding for sHSPs has been identified; this represent a valuable tool for elucidate gene function and to produce new durum wheat varieties with increased adaptation capabilities to heat stress.