Different routes to pure food allergens: extraction, recombinant techniques and total chemical synthesis for obtaining the plant-food pan-allergen LTP

Abstract

La richiesta di allergeni puri è in continuo aumento per scopi diagnostici, come standard per metodi di rilevamento e di quantificazione, per l'immunoterapia e per lo studio a livello molecolare dei meccanismi delle reazioni allergiche, al fine di facilitare lo sviluppo di possibili cure. In questa tesi di dottorato sono descritte diverse strategie per l’ottenimento di forme pure di non-specific Lipid Transfer Proteins (nsLTPs), le quali sono state riconosciute essere rilevanti allergeni alimentari in molti frutti e verdure comunemente consumati e sono state definite come modello di veri allergeni alimentari. Una LTP potenzialmente allergenica, non nota in precedenza, è stata isolata dalle mandorle, mentre una LTP dall’allergenicità nota contenuta nelle noci è stata prodotta mediante tecniche di DNA ricombinante. Oltre a questi approcci classici, metodi per la sintesi chimica totale di proteine sono stati applicati per la prima volta alla produzione di un allergene, utilizzando Pru p 3, la LTP prototipica e principale allergene della pesca nell'area mediterranea, come modello. La sintesi chimica totale di proteinepermette di controllarne completamente la sequenza e di studiare la loro funzione a livello atomico. La sua applicazione alla produzione di allergeni costituisce perciò un importante passo avanti nel campo della ricerca sulle allergie alimentari. La proteina Pru p 3 è stata prodotta nella sua intera lunghezza e sono necessari solo due passaggi finali di deprotezione per ottenere il target nella sua forma nativa. Le condizioni sperimentali per tali deprotezioni sono state messe a punto durante la produzione dei peptidi sPru p 3 (1-37) e sPru p 3 (38-91), componenti insieme l'intera proteina. Tecniche avanzate di spettrometria di massa sono state usate per caratterizzare tutti i composti ottenuti, mentre la loro allergenicità è stata studiata attraverso test immunologici o approcci in silico.

Pure allergens are increasingly required for diagnostic purposes, as standards for detection and quantification methods, for immunotherapy and for the study of the mechanisms of allergic reactions at a molecular level, in order to ease the development of possible cures. In this PhD thesis, different strategies for obtaining pure non-specific Lipid Transfer Proteins (nsLTPs), which were recognized as being relevant food allergens in many commonly consumed fruits and vegetables and were defined as models for true food allergens, are described. A novel potentially allergenic LTP was isolated from almond, while a known allergenic LTP from walnut was produced by means of recombinant DNA techniques. Besides these classical approaches, methods for the total chemical synthesis of proteins were applied for the first time to the production of an allergen, using Pru p 3, the prototypic LTP and major allergen of peach in the Mediterranean area, as a model. Total chemical synthesis of proteins allows to completely control their sequence and to study their function at atomic resolution. Thus, its application to the production of allergens constitutes an important step forward in the research field of food allergy. The whole protein stretch of Pru p 3 was produced and only two final deprotection steps are needed to obtain the target in its native form. The experimental conditions for those deprotections were set up during the production of the peptides sPru p 3 (1-37) and sPru p 3 (38-91), composing together the entire protein. Advanced mass spectrometry techniques were used to characterise all the obtained compounds, while their allergenicity was studied through immunological tests or in silico approaches.