Structural and cellular characterization of Idiopathic Pulmonary Fibrosis

Abstract

La Fibrosi Polmonare Idiopatica (IPF) è una malattia polmonare cronica, irreversibile la cui eziologia risulta essere ignota, caratterizzata da un processo fibrotico progressivo che inizia nel tratto respiratorio inferiore. Le persone affette da IPF presentano età media compresa tra 55 e 77 anni. L’incidenza annuale di IPF è stata recentemente stimata tra 14 e 42,7 casi per 100.000 persone e tale dato risulta essere in aumento. IPF fa parte delle malattie Polmonari Idiopatiche Interstiziali (IIP) che comprendono patologie con quadri istologici e clinici differenti. Le affezioni su cui si concentrerà questo studio sono: UIP (Usual Interstitial Pneumonia) caratterizzata da fibrosi interstiziale e dalla presenza di foci fibrotici connessi alla pleura e corrispondente al quadro anatomopatologico della maggior parte dei casi di IPF; NSIP (Non Specific Interstitial Pneumonia) simile alla UIP ma con maggiore uniformità temporale e spaziale delle manifestazioni; Sarcoidosi, malattia granulomatosa ad eziologia ignota. Attualmente la gravità della IPF, che implica una mortalità del 50% dei pazienti a 5 anni dall’esordio, e la scarsa efficacia farmacologica nel rallentarne la progressione vedono il trapianto polmonare come unica possibilità di sopravvivenza nelle forme più severe. Al momento non è chiaro il meccanismo patogenetico di insorgenza e progressione della IPF anche se sono stati individuati alcuni fattori scatenanti quali fumo di sigaretta, infezioni respiratorie e inquinanti atmosferici; tuttavia nessuno di tali elementi può da solo determinare un così esteso e progressivo rimodellamento del parenchima polmonare. Numerose sono le evidenze di come il substrato genetico, le alterazioni del rapporto morte/proliferazione cellulare e le citochine svolgano un ruolo nella genesi e nella progressione della malattia, ma non sono ancora chiari i fenomeni biologico-cellulari che la sostengono e, quindi, quali siano i punti di attacco per poter incidere terapeuticamente nel modificare l’evoluzione della IPF. Poiché il nostro laboratorio ha partecipato alla scoperta dell’esistenza di cellule staminali nel polmone umano normale, uno degli obiettivi finali di questo progetto si basa sull’ipotesi che un’alterazione del compartimento staminale svolga un ruolo cruciale nella eziopatogenesi di IPF. Per questo in precedenti esperienze abbiamo cercato di identificare nella IPF cellule che esprimessero antigeni associati a staminalità quali c-kit, CD34 e CD133. Questo lavoro di tesi si è proposto di condurre un’indagine morfometrica ed immunoistochimica su biopsie polmonari provenienti da 9 pazienti affetti da UIP, 3 da NSIP e 5 da Sarcoidosi al fine di valutare le alterazioni strutturali principali imputabili alle patologie. Preparati istologici di 8 polmoni di controllo sono stati usati come confronto. Come atteso, è stato osservato nelle tre patologie esaminate (UIP, NSIP e Sarcoidosi) un significativo incremento nella sostituzione del parenchima polmonare con tessuto fibrotico ed un ispessimento dei setti alveolari rispetto ai campioni di controllo. L’analisi dei diversi pattern di fibrosi presenti fa emergere come vi sia una netta differenza tra le patologie con una maggiore presenza di fibrosi di tipo riparativo e quindi altamente cellulata nei casi di UIP, e NSIP mentre nelle Sarcoidosi il pattern maggiormente rappresentato è risultato essere quello della fibrosi replacement o sostitutiva. La quantificazione delle strutture vascolari è stata effettuata tenendo separate le aree di polmone alveolare rispetto a quelle occupate da focolai sostitutivi di danno (componente fibrotica). Nei campioni patologici analizzati era presente un significativo riarrangiamento di capillari, arteriole e venule rispetto al polmone di controllo, fenomeno principalmente riscontrato nel parenchima fibrotico. Tali modifiche erano maggiormente presenti nei casi di NSIP da noi analizzati. Inoltre le arteriole subivano una diminuzione di calibro ed un aumento dello spessore in special modo nei polmoni ottenuti da pazienti affetti da Sarcoidosi. Rispetto ai controlli, nella UIP e nella Sarcoidosi i vasi linfatici risultavano inalterati nell’area alveolare mentre aumentavano nelle aree di estesa fibrosi; quadro differente si osservava nella NSIP dove le strutture linfatiche aumentavano in entrambe le componenti strutturali. Mediante indagini immunoistochimiche è stata documentata la presenza e distribuzione dei miofibroblasti, positivi per actina muscolare liscia e vimentina, che rappresentano un importante componente del danno tissutale nella IPF. La quantificazione di questo particolare fenotipo è attualmente in corso. Abbiamo inoltre analizzato tramite immunoistochimica la componente immunitaria presente nei campioni polmonari attraverso la documentazione dei linfociti T totali che esprimono CD3, andando poi a identificare la sottopopolazione di T citotossici esprimenti la glicoproteina CD8. La popolazione linfocitaria CD3pos risultava notevolmente aumentata nelle tre patologie analizzate soprattutto nei casi di UIP e Sarcoidosi sebbene l`analisi della loro distribuzione tra i vari distretti tissutali risultasse differente. Risultati simili si sono ottenuti per l`analisi dei linfociti CD8pos. La componente monocito-macrofagica è stata invece identificata tramite la glicoproteina CD68 che ha messo in evidenza una maggiore presenza di cellule positive nella Sarcoidosi e nella UIP rispetto ai casi di NSIP. I dati preliminari di questo studio indicano che il rimodellamento strutturale emo-linfatico e cellulare infiammatorio nella UIP si differenziano rispetto alle altre malattie interstiziali del polmone, avanzando l’ipotesi che il microambiente vascolare ed immunitario giochino un ruolo importante nella patogenesi della malattia

Interstitial lung diseases (ILD) are a heterogeneous group of noninfectious diffuse infiltrative disorders characterized by alveolar septal thickening, fibroblast proliferation, collagen deposition that ultimately results in a decline in lung function and respiratory failure. Idiophatic Pulmonary Fibrosis (IPF), also known as cryptogenic fibrosis alveolitis, is the most common interstitial lung disease of unknown etiology and is associated with a histopathological or radiological pattern typical of usual interstitial pneumonia. Patients with IPF are usually over 50 years of age at the time of the presentation, with men being affected slightly more often than women. The main histopathological features of IPF, best seen at low magnification, is a heterogeneous appearance with areas of subpleural and paraseptal fibrosis and alternating with areas of less affected or normal parenchyma (spatial heterogeneity). Several hypotheses have been advanced about the pathogenic mechanisms underlying the clinical-pathological variants of ILD; although defining a unique model to date appears to be difficult. New evidence on the key role played by myofibroblasts in the onset and progression of the disease make the current clinical trials far from an efficient therapeutic approach able to modifying the natural course of the disease. In such a complex and problematic disease, is necessary to expand the basic knowledge on the biology of the cell populations involved in the pathogenic processes of ILD. This possibilities is made difficult by the limited availability of human pathological tissues appropriate in size and quality for a thorough investigation. This thesis aims to conduct a morphometric and immunohistochemical analysis on lung biopsies from patients with UIP, NSIP and Sarcoidosis in order to identify potential differences in the structural and cellular characteristics and their potential impact on the pathogenesis of the disease. As expected, in pathologic samples, a significant change in tissue composition was present compared to control: alveolar area decreased of 28.7% and 28.8% in UIP and Sarcoidosis respectively. Histologic investigation performed on Trichrome Masson’s stained sections documented a significant amount of collagen deposition in all three pathologic conditions and the analysis of the different patterns of lung fibrosis showed a differential distribution with a higher incidence of reparative fibrosis in UIP, of interalveolar fibrosis in NSIP and substitutive fibrosis in Sarcoidosis. To evaluate the hypothesis that the vascular microenvironment plays a role in the pathogenesis of idiopathic interstitial lung diseases, a morphometric analysis on capillaries, arterioles and venules was performed. Immunohistochemical detection of CD34 in pathological samples, showed a rearrangement of capillary structures with respect to control lungs. The evaluation of arteriolar profiles was performed by the immunohistochemical detection of alfa-smooth muscle actin (α-SMA). This investigation revealed a significant increase of these structures in all subclass of lung diseases Arteriolar size was also measured allowing a subdivision into five classes according to the external diameter. A general decrease in arteriolar dimensions was documented when compared to controls, with an exacerbation of this phenomenon in Sarcoidosis where the percentage of small arterioles (diameter <10m ) reached about 17% representing a 2.48-fold increase compared to controls. The immunohistochemical analysis of immune-inflammatorycells in lung samples was carried out through the detection of total T lymphocytes expressing CD3, CD8 positive T cytotoxic lymphocytes and macrophages expressing CD68 antigen. CD3pos lymphocytes were significantly increased in all three pathologic states of the lung when compared to control. More relevant data were obtained by a further analysis of the distribution ofCD3 lymphocytes among the different tissue areas of the lung. In Sarcoidosis, most lymphocytes were localized in granulomaswhile in UIP and NSIP CD3pos cells were present in the interstitial space as located in intraepithelial areas between type II hyperplastic pneumocytes. A similar distribution was observed for CD8pos T cytotoxic lymphocytes. The monocyte-macrophage component, as identified by the CD68 glycoprotein was increased in all analyzed pathologic samples when compared to the control lungs. Preliminary data from this study indicate that structural remodeling emo-lymphatic and inflammatory cell in UIP are different from other interstitial lung diseases, advancing the hypothesis that vascular and immune microenvironment play an important role in the pathogenesis of the disease.