Identification and characterization of periplasmic proteins implicated in the adaptation of Helicobacter pylori to the human gastric niche

Abstract

Helicobacter pylori è un batterio Gram-negativo in grado di colonizzare la mucosa gastrica umana e persistere per l'intero arco della vita dell'ospite. E' associato a patologie gastrointestinali, quali gastrite cronica, ulcere gastriche e duodenali, adenocarcinomi e linfomi gastrici. Si tratta di uno dei patogeni più diffusi, presente in circa metà della popolazione mondiale, e il solo che si è adattato a vivere nell'ambiente ostile dello stomaco umano. Molteplici sono i fattori di virulenza che permettono al batterio la colonizzazione della nicchia gastrica e contribuiscono, anche attraverso l' induzione di una risposta infiammatoria, a profonde modificazioni dell' omeostasi gastrica. Queste ultime si associano, ad esempio, all'iperproduzione di fattori proinfiammatori, ad alterazioni sia della regolazione della secrezione acida gastrica sia del ciclo cellulare e della morte cellulare programmata (apoptosi) delle cellule epiteliali gastriche, a disordini nel metabolismo del ferro e a carenze di elementi essenziali. Studi sulla diversità genetica di H. pylori osservata in ceppi isolati da varie regioni del mondo, dimostrano che tale batterio ha avuto una coevoluzione col genere umano attraverso la storia, ed è verosimile che H. pylori sia stato un costituente del microbiota gastrico per almeno 50.000 anni. Scopo della tesi è stato quello di identificare e caratterizzare proteine importanti per la colonizzazione e l'adattamento di H. pylori alla nicchia gastrica. In particolare gli sforzi si sono concentrati su due proteine periplasmatiche, la prima coinvolta nella difesa antiossidante (l'enzima catalasi-like, HP0485), e la seconda nel trasporto di nutrienti presenti nell'ambiente dello stomaco all'interno della cellula (la componente solubile di un ABC transporter, HP0298). La strategia utilizzata prevede un'analisi bioinformatica preliminare, l'ottenimento del gene per amplificazione, mediante PCR, dal genoma dell'organismo, la costruzione di un vettore per il clonaggio, l'espressione eterologa in E. coli e la successiva purificazione. La proteina così ottenuta viene caratterizzata mediante diverse tecniche, quali spettroscopia UV, dicroismo circolare, gel filtrazione analitica, spettrometria di massa. Il capitolo 1 contiene un'introduzione generale sul batterio, il capitolo 2 e il capitolo 3 descrivono gli studi relativi alle due proteine e sono entrambi suddivisi in un abstract iniziale, un'introduzione, la presentazione dei risultati, la discussione di questi ultimi, i materiali e i metodi utilizzati. La catalasi-like (HP0485) è una proteina periplasmatica con struttura monomerica, appartenente ad una famiglia di enzimi a funzione per la maggior parte sconosciuta, ma evolutivamente correlati alla ben nota catalasi, attore fondamentale nella difesa di H. pylori, grazie alla sua azione specifica di rimozione dell'acqua ossigenata. HP0485, pur conservando il fold catalasico e il legame al cofattore eme, non può compiere la reazione di dismutazione dell'acqua ossigenata; possiede invece un'attività perossidasica ad ampio spettro, essendo in grado di accoppiare la riduzione del perossido di idrogeno all'ossidazione di diversi substrati. Come la catalasi, lavora ad alte concentrazioni di aqua ossigenata e non arriva a saturazione a concentrazioni molto elevate di questo substrato (200 mM); la velocità di reazione catalizzata rimane lineare anche a questi valori, aspetto che la differenzia dalle perossidasi che vengono in genere inattivate da concentrazioni di perossido di idrogeno superiori a 10-50 mM. Queste caratteristiche di versatilità e robustezza suggeriscono che la catalasi-like abbia un ruolo di scavenger dell'acqua ossigenata e probabilmente anche un'altra funzione connessa al suo secondo substrato, ossia l'ossidazione di composti nello spazio periplasmatico cellulare. Oltre alla caratterizzazione dell'attività è descritta anche la presenza di un ponte disolfuro, conservato nelle catalasi-like periplasmatiche, con un ruolo nell'assemblaggio dell'eme per ottenere un enzima attivo e funzionale. La proteina periplasmatica HP0298, componente di un sistema di trasporto ABC, è classificata come trasportatore di dipeptidi e appartiene a una famiglia di proteine in grado di legare diversi substrati, tra cui di- e oligopeptidi, nichel, eme, glutatione. Benchè tutte associate a trasportatori di membrana batterici, queste proteine presentano un dominio di legame al substrato che risulta essere conservato nei domini extracellulari di recettori specifici di mammifero e uomo. Un esempio sono i recettori ionotropici e metabotropici del sistema nervoso. Per caratterizzare questa proteina è stato messo a punto un protocollo di ligand-fishing accoppiato alla spettrometria di massa. La proteina purificata, avente un tag di istidine, è stata incubata con un estratto cellulare di H. pylori per poter interagire con il suo substrato specifico all'interno dell'ambiente naturale in cui avviene il legame. Il complesso proteina-ligando è stato poi purificato per cromatografia di affinità e analizzato mediante HPLC-MS. L'identificazione dei picchi differenziali tra campioni con la proteina e 5 campioni di controllo ha portato alla caratterizzazione di pentapeptidi particolarmente ricchi in aminoacidi idrofobici e con almeno un residuo carico negativamente. Considerando che H. pylori necessita di alcuni aminoacidi essenziali, per la maggior parte idrofobici, e che lo stomaco umano è particolarmente ricco di peptidi prodotti dalla digestione delle proteine introdotte con il cibo, il ruolo fisiologico di HP0298 potrebbe essere l'internalizzazione di peptidi, con caratteristiche specifiche di lunghezza e composizione, che sono naturalmente presenti nella nicchia gastrica.

Helicobacter pylori, a Gram-negative, microaerophilic bacterium that colonizes the stomach of half the world population, is the main cause of chronic gastritis, peptic ulceration, gastric lymphoma, and gastric adenocarcinoma. H. pylori has been coevolving with humans for at least 50,000 years, colonizing the stomach in childhood and persisting throughout life, in the absence of antibiotic treatment. This implies near perfect adaptation to the niche and the ability to evade the host immune response. The aim of this thesis was to identify and characterize important factors for the colonization and adaptation of H. pylori to the gastric environment. In particular, I present the results of the study of two periplasmic proteins: the first one involved in the bacterium antioxidant defense (Hp catalase-like, HP0485), the second one with a role in nutrient uptake from the stomach milieu (Hp dipeptide binding protein, HP0298). Chapter one contains a general introduction on the bacterium, chapters two and three describe the studies of the two proteins and both include an abstract, introduction, results, discussion, materials and methods. H. pylori catalase-like (HP0485) is a periplasmic protein, with a monomeric structure, belonging to a family of enzymes structurally related to catalase, but of undefined function. Despite the conservation of the catalase fold and the heme cofactor, HP0485 is not capable of catalyzing the dismutation of H2O2 (catalatic reaction), but a broad spectrum peroxidatic reaction, by coupling the hydrogen peroxide reduction with the oxidation of various one-electron donor substrates. Similarly to catalase, Hp catalase-like works at high H2O2 concentrations, being not saturated up to elevated H2O2 levels (200 mM). The reaction rate increases exponentially and the enzyme does not loose activity even at these high values of the peroxide, at variance with peroxidases that are usually inactivated by H2O2 concentrations higher than 10-50 mM. This catalytic versatility and robustness suggests that Hp catalase-like has a role in H2O2 scavenging, and probably another function linked to the oxidation of a reduced substrate in the cell periplasm. In addition to the characterization of enzymatic activity, we propose a model for the heme assembly mechanism in the periplasm that involves the formation of a disulfide bond, identified as a hallmark of secreted catalase-like proteins. The dipeptide binding protein of H. pylori (Hp DppA, HP0298) is the periplasmic component of an ABC importer system that appears to be specific of gastric species. Periplasmic binding proteins (PBPs) exhibit ligand promiscuity, but a very well conserved binding domain, that is found in many mammalian and human receptors, including for example, metabotropic glutamate and GABA receptors. To investigate Hp DppA physiologic substrate, we set up a protocol of "ligand-fishing" coupled with mass spectrometry. The His-tagged purified protein acts as the bait to capture its specific ligand within the endogenous environment in which the binding occurs, that is H. pylori cell extract. The protein-ligand complex is then purified through affinity chromatography and analyzed by HPLC-MS. The compounds that potentially interact with DppA were pentapeptides, rich in hydrophobic amino acids and containing at least one negative charged residue. Since H. pylori is auxotrophic for some amino acids, mostly hydrophobic, and the human stomach is rich of peptides produced by food protein digestion, Hp DppA could have a role in the uptake of peptides with specific length and amino acid composition that are naturally present in the gastric niche.