Alterazione della proteostasi a livello del reticolo endoplasmatico: un potenziale target terapeutico nel carcinoma prostatico

Abstract

Nel sesso maschile il carcinoma della prostata (CaP) è la neoplasia più frequente ed è tra le prime cause di morte per tumore. Ad oggi, sono disponibili diverse strategie terapeutiche per il trattamento del CaP, ma, come comprovato dall’ancora alta mortalità, spesso queste sono inefficaci, a causa soprattutto dello sviluppo di fenomeni di resistenza da parte delle cellule tumorali. La ricerca si sta quindi focalizzando sulla caratterizzazione di tali meccanismi di resistenza e, allo stesso tempo, sull’individuazione di combinazioni terapeutiche che siano più efficaci e capaci di superare queste resistenze. Le cellule tumorali sono fortemente dipendenti dai meccanismi connessi con l’omeostasi proteica (proteostasi), in quanto sono sottoposte a numerosi stress ambientali (ipossia, carenza di nutrienti, esposizione a chemioterapici, ecc.) e ad un’aumentata attività trascrizionale, entrambi fattori che causano un accumulo intracellulare di proteine anomale e/o mal ripiegate, le quali possono risultare dannose per la cellula e vanno quindi riparate o eliminate efficientemente. La cellula ha sviluppato diversi sistemi di controllo di qualità delle proteine, tra cui gli chaperon molecolari, il sistema di degradazione associato al reticolo endoplasmatico (ERAD), il sistema di risposta alle proteine non ripiegate (UPR) e i sistemi di degradazione come il proteasoma e l’autofagia. Uno dei possibili bersagli in cellule tumorali secretorie, come quelle del CaP, è rappresentato dal reticolo endoplasmatico (RE), organello intracellulare deputato alla sintesi, al ripiegamento e alle modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete. Alterazioni della protestasi a livello del RE inducono l’UPR, che svolge una duplice funzione nella cellula: primariamente funge da meccanismo omeostatico e di sopravvivenza, ma, quando l’omeostasi non è più ripristinabile e lo stimolo di attivazione dell’UPR cronicizza, può attivare vie di segnalazione che conducono alla morte cellulare programmata. La bivalenza, tipica dell’UPR, lo rende un bersaglio particolarmente interessante per promuovere la morte delle cellule tumorali: si può, infatti, sfruttare da una parte l’inibizione di componenti dell’UPR per abrogare i meccanismi adattativi e di sopravvivenza e dall’altra si può favorire il sovraccarico dell’UPR con conseguente induzione della via pro-apoptotica. Le catechine del tè verde sono composti polifenolici estratti dalle foglie di Camellia sinesis che possiedono comprovati effetti antitumorali: inibiscono la proliferazione, inducono la morte di cellule neoplastiche e riducono l’angiogenesi, l’invasione e la metastatizzazione di diversi tipi tumorali, tra cui il CaP. Diversi studi hanno osservato come il RE sia uno dei bersagli molecolari delle catechine del tè verde. In particolare, recenti studi del nostro gruppo di ricerca hanno messo in evidenza come il Polyphenon E (estratto standardizzato di catechine del tè verde) sia in grado, in modelli animali di CaP, di causare un’alterazione strutturale del RE e del Golgi, un deficit del processamento delle proteine secretorie e la conseguente induzione di uno stato di stress del RE, il quale causa a sua volta l’attivazione delle vie di segnalazione dell’UPR. Nel presente studio su due diverse linee cellulari di CaP (LNCaP e DU145) e in un nostro precedente studio su altre due linee cellulari (PNT1a e PC3) è stato confermato che il Polyphenon E è capace di indurre lo stress del RE e di determinare l’attivazione delle vie di segnalazione dell’UPR, le quali possono fungere da meccanismo di sopravvivenza, ma anche contribuire a favorire la morte cellulare indotta dalle catechine del tè verde (come nel caso delle PC3). Considerati questi effetti delle catechine del tè verde in qualità di induttori dell’UPR, abbiamo ipotizzato che la combinazione di questi polifenoli bioattivi e degli inibitori del proteasoma, anch’essi noti attivatori dell’UPR, potesse comportare un aggravamento dell’UPR stesso tale da innescare meccanismi molecolari di morte cellulare programmata. Abbiamo quindi studiato l’effetto di tale combinazione in cellule PC3 trattate con epigallocatechina-3-gallato (EGCG, la principale tra le catechine del tè verde) e due diversi inibitori del proteasoma, il bortezomib (BZM) e l’MG132. I risultati hanno dimostrato, diversamente da quanto ipotizzato, che l’EGCG quando associato agli inibitori del proteasoma non produce effetti sinergici, ma che anzi, quando viene addizionato al BZM, causa una risposta simil-antagonistica: si osserva infatti una riduzione della citotossicità e dell’effetto inibitorio sul proteasoma (accumulo di proteine poliubiquitinate) indotti dal BZM, inoltre anche l’induzione dell’UPR (aumento di GRP78, p-eIF2α, CHOP) risulta ridotta nelle cellule trattate con la combinazione di EGCG e BZM rispetto alle cellule trattate col solo BZM. Gli stessi effetti non si osservano invece nelle cellule PC3 trattate con l’EGCG in associazione con l’MG132, dove non si registra alcuna variazione dei parametri di vitalità cellulare e dei marcatori di inibizione del proteasoma e di UPR (rispetto a quelli osservati nel singolo trattamento con MG132). Essendo l’autofagia un meccanismo compensativo che si attiva in seguito all’inibizione del proteasoma o allo stress del RE, abbiamo valutato che ruolo potesse avere tale meccanismo nella risposta simil-antagonistica osservata in seguito al co-trattamento con EGCG e BZM. I nostri risultati hanno evidenziato, in cellule trattate con BZM, l’attivazione di un flusso autofagico che si intensifica quando viene addizionato l’EGCG. Tramite l’inibizione dell’autofagia mediante co-somministrazione di clorochina, è stato possibile stabilire che l’autofagia indotta dall’EGCG favorisce la sopravvivenza delle cellule sottoposte al trattamento combinato tramite la riduzione dell’UPR. Queste evidenze ci portano a concludere che per il trattamento del CaP è sconsigliabile associare le catechine del tè verde con il BZM e che in futuri studi di combinazione di questi polifenoli con composti antitumorali sarà importante valutare il ruolo dell’autofagia come possibile meccanismo di resistenza.

Prostate cancer (PCa) is the most frequently diagnosed neoplasia and the third leading cause of cancer-related death among men. Different therapeutic strategies are available for treatment of PCa but, as demonstrated by the persistent high mortality, they are often ineffective, mainly because of the development of resistant cancer cells. Researchers are focusing on the characterization of these resistance mechanisms and also on identifying new therapeutic combinations that can be more effective and able to overcome the resistance of cancer cells. Tumor cells are highly dependent on protein homeostasis (proteostasis) because they are continuously exposed to stressful conditions (such as hypoxia, nutrient deprivation, acidosis, chemotherapeutic treatments, etc.) and are characterized by a high translational activity; therefore, they are much more prone to accumulate misfolded and/or unfolded proteins. For the maintenance of proteostasis, eukaryotic cells have developed a complex protein quality control system, which is mainly comprised of molecular chaperons, the endoplasmic reticulum (ER)-associated degradation (ERAD), the unfolded protein response (UPR) and the two major protein degradation systems, i.e. the proteasome system and autophagy. One of the potential therapeutic target in secretory cells, such as PCa cells, is the ER, an intracellular organelle that plays a central role in the synthesis, folding and post-translational modification of secreted and membrane proteins. Proteostasis impairment at the level of the ER induces the UPR, which plays a dual role in cells: it mainly acts as a homeostatic and pro-survival mechanism, but it can also induce pro-death pathway when the proteostasis can not be restored and the UPR signalling becomes chronic. Therefore, the UPR is a two-faced response that can be exploited to selectively target tumor cells. In cancer, the inhibition of the UPR could abrogate the adaptative and pro-survival response, whereas its overloading could trigger the activation of pro-apoptotic pathways. Green tea catechins are polyphenolic compounds extracted from leaves of Camellia sinensis and have many antitumor effects. Green tea catechins inhibit cell proliferation, increase cancer cell death and reduce the invasion, angiogenesis and metastasis of different kind of tumors, including PCa. The ER has been characterized as a target of green tea catechins. Especially, recent studies in a PCa animal model performed by our research group have highlighted that Polyphenon E (a standardized green tea extract) causes the collapse of Golgi and interferes with the glycosylation capacity of the ER, causing the accumulation of immature proteins within the lumen, thus triggering ER stress. In the present study on two different PCa cell lines (DU145 and LNCaP) and in a previous study by us on two other cell lines (PNT1a and PC3), we confirm that Polyphenon E is able to induce ER stress and, consequently, UPR signalling, which can act as a early prosurvival mechanism, but can also contribute to the activation of pro-death pathways, as evidenced in PC3 cells. Taking into consideration the ability of green tea catechins to induce UPR, we hypothesized whether the combination of these bioactive polyphenols with proteasome inhibitors (well known UPR inducers) can trigger a synergistic overloading of the UPR, thus inducing UPR-mediated pro-apoptotic pathway (such as via the PERK-p-eIF2α-ATF4-CHOP pathway). Therefore, in PC3 cells, we tested the combination of epigallocatechin-3-gallate (EGCG, the main green tea catechin) with two different proteasome inhibitors, bortezomib (BZM) and MG132. Surprisingly, the combination treatments did not trigger a synergistic or additive effect. Instead, EGCG when combined with BZM resulted in an antagonistic-like effect: the combination caused a reduction of the cytotoxicity and proteasome inhibition as compared to the single treatment with BZM. Moreover, the association of EGCG and BZM reduced the induction of the ER stress and the UPR, as shown by the lower levels of GRP78, p-eIF2α and CHOP compared to the single treatment with BZM. Conversely, the combination of EGCG with MG132 did not alter the cytotoxicity, proteasome inhibition and UPR induction triggered by MG132 when used as a single agent. Since autophagy is a compensative mechanism that can be induced as a consequence of proteasome inhibition and ER stress induction, we studied the role played by autophagy in the antagonistic-like response observed in PC3 cells treated with EGCG and BZM. Our results showed that EGCG increased the activation of the autophagic flux induced by BZM. Through the inhibition of autophagy by chloroquine co-administration, we demonstrated that EGCG-induced autophagy is a pro-survival mechanism that suppresses the UPR triggered by BZM. In conclusion, our results prove that the co-administration of green tea catechins and BZM should be avoided in patient with PCa. Moreover, in future combinatorial studies of EGCG, it will be important to verify the role of autophagy as a potential pro-survival and resistance mechanism.