Endometrial response toward bovine herpesvirus 4 infection

Abstract

Metriti ed endometriti sono le patologie maggiormente responsabili delle perdite economiche negli allevamenti bovini da latte, specialmente nel periodo successivo al parto. Mentre le metriti coinvolgono e si sviluppano in tutto l’utero e sono caratterizzate dalla presenza di sintomi sistemici, le endometriti consistono in una infiammazione che riguarda il solo endometrio, con la presenza di perdite purulente, distruzione della superficie epiteliale, congestione vascolare, edema stromale ed accumulo di linfociti e plasmacellule. Queste patologie, inoltre, possono causare, disfunzione ovarica, con conseguente infertilità e riduzione sia dell’efficienza riproduttiva della vacca sia della produzione stessa di latte. Nonostante queste malattie siano, nella maggior parte dei casi, correlate all’instaurarsi di infezioni batteriche, che possono subentrare nell’utero direttamente durante il parto, il ruolo di alcuni virus nello sviluppo di queste patologie è stato recentemente approfondito e la correlazione tra l’ Herpesvirus Bovino 4 e l’insorgere di metriti ed endometriti è stata dimostrata. L’ Herpesvirus Bovino 4 (BoHV-4) è un gamma-herpesvirus ed il suo genoma è costituito da una molecola lineare di DNA a doppio filamento con una struttura genomica di tipo B, caratterizzata dalla presenza di un’unica lunga sequenza centrale (LUR) fiancheggiata da multiple sequenze poli-ripetute (prDNA). BoHV-4 è stato isolato sia da animali sani sia da animali con differenti patologie, tra cui malattie oculari e respiratorie, ma soprattutto da casi di metriti, endometriti, vaginiti o aborti. Generalmente, il ruolo svolto dal virus in questo tipo di patologie è associato alla compresenza di altri tipi di patogeni, che possono essere virus, come nel caso del Virus Della Diarrea Virale Bovina (BVDV), o più frequentemente batteri. Usualmente, l’iniziale difesa dell’endometrio bovino nei confronti dei microbi si fonda sul sistema immunitario innato e l’attivazione di specifici recettori cellulari determina la sintesi e la produzione di citochine e chemochine pro infiammatorie, che possono essere in grado di modulare la replicazione di BoHV-4. Il genoma di BoHV-4 possiede due principali trascritti per i geni Immediate Early (IE), trai quali ORF50/IE2 è il più importante ed il suo prodotto, Rta/ORF50, è fortemente conservato tra tutti gli Herpesvirus. Esso è responsabile della diretta trans-attivazione di numerosi geni virali e cellulari e può essere modulato da differenti stimoli extracellulari. Precedentemente è stato dimostrato come il TNF-, prodotto dalle cellule stromali e dai macrofagi all’interno dell’endometrio, in conseguenza ad infezione batterica, sia in grado di aumentare la replicazione di BoHV-4 attraverso l’attivazione del pathway di NFkB e direttamente agendo sul promotore di IE2. Per queste ragioni, è risultato di forte interesse investigare quali potessero essere, invece, i fattori limitanti la replicazione di BoHV-4. In questo lavoro è stata studiata la relazione tra cellule endometriali stromali bovine infettate con l’Herpesvirus Bovino 4 e l’interferon gamma (IFN-) ed è stata dimostrata la capacità di questa molecola di restringere la replicazione di BoHV-4 in maniera IDO1 indipendente ed IE2 dipendente. Inoltre, la presenza di alcuni elementi in grado di interagire con l’ IFN-γ, all’interno del promotore di IE2 di BoHV-4, ha confermato questa ipotesi. Basandoci su questi dati, abbiamo potuto supporre l’esistenza di uno stretto vincolo tra l’attivazione dell’asse dell’interferon gamma e la ridotta replicazione di BoHV-4, andando a porre le basi per una nuova efficiente cura e prevenzione per le patologie uterine. Poiché il meccanismo corretto attraverso il quale BoHV-4 infetta l’endometrio bovino non è ancora ben compreso, è stato interessante approfondire in maniera più accurata l’interazione presente tra il virus ed il substrato endometriale, analizzando le differenze esistenti tra cellule infettate e non, in termini di espressione genica. Basandoci su dati preliminari ottenuti attraverso analisi con RNA sequencing (RNAseq), abbiamo visto come numerosi geni risultino over-espressi in seguito ad infezione con BoHV-4 e come, tra questi, la Metalloproteasi 1 sia uno dei più interessanti, a causa delle sue possibili implicazioni nello sviluppo delle patologie dell’endometrio uterino bovino. Successive analisi, effettuate tramite westernblotting e real time PCR, sono state in grado di confermare tale dato, sottolineando l’efficacia di un nuovo approccio sperimentale, basato sul RNAseq, per lo studio dell’insorgenza delle patologie.

Metritis and endometritis are the main responsible of great economical loss inside dairy herds, especially in post partum period. While the first one involves all the uterus and it is especially characterized by the presence of systemic symptoms, the second one consists of the inflammation of the only endometrium, with the presence of purulent discharge, destruction of epithelial surface, vascular congestion, stromal edema and accumulation of lymphocytes and plasma cells. These pathologies can cause ovarian dysfunction, leading to infertility or reduction of conception rate, but also abortion and decreasing in milk production. Although they are usually related to bacterial infection, which can overcomes inside uterus directly during parturition, the role of some viruses in the development of uterine diseases was recently investigated and the relationship between Bovine Herpesvirus type 4 and the onset of metritis and endometritis was demonstrated. Bovine Herpesvirus type 4 (BoHV-4) is a gamma-herpesvirus and its genome is constituted by a linear double stranded DNA molecule with a B-type structure, characterized by the presence of a long unique genome region (LUR) flanked by poly-repetitive DNA (prDNA) elements. It was isolated both from healthy and from cattle with diseases, such as ocular and respiratory diseases, but especially from cows with metritis, endometritis, vaginitis or abortion. Usually, the role played by the virus in this kind of pathologies is associated to the co-presence with other pathogens, which could be other viruses, such as the Bovine Viral Diarrhea virus (BVDV) in the case of abortion, as well as bacteria. Generally, The initial defense of the bovine endometrium against microbes is dependent on the innate immune system and the activation of some specific cellular receptors determines the synthesis and production of several pro-inflammatory cytokines and chemokines, which can modulate BoHV-4 replication. BoHV-4 genome possesses two major Immediate Early (IE) RNAs, among which ORF50/IE2 is the most important and its product, called Rta/ORF50, is well conserved among Herpesviruses. It is responsible of the direct trans-activation of many cellular or viral genes and it can be modulated by different extracellular stimuli too. Previously, it was demonstrated how TNF-, produced by stromal cells and macrophages inside endometrium, as a consequence of bacterial infection, is able to enhance BoHV-4 replication through the activation of NFkB pathway, directly acting on Immediate Early 2 gene (IE2) promoter activation. For these reasons, it was interesting to investigate how BoHV-4 replication could be decreased. In this work, the interaction between Bovine Herpesvirus 4 (BoHV-4) infected bovine endometrial stromal cells (BESCs) and interferon gamma (IFN-) was investigated and the capability of this molecule to restrict BoHV-4 replication in a IDO1 independent and IE2 dependent manner was demonstrated. Furthermore, the presence of a potential responsive elements (RE) interacting with inhibitory transcription factors induced by IFN-γ inside BoHV-4 IE2 gene promoter confirmed this hypothesis. Basing on these data, we could suppose the relationship between IFN- axis activation and the reduced BoHV-4 replication, paving the way to new efficient treatment and prevention of uterine diseases. Furthermore, as the right mechanism by which BoHV-4 infects the endometrial substrate is not still understood, it was of interest to deeply investigate the interaction between the virus and the endometrial layer, analyzing the differences showed by BoHV-4 infected and uninfected bovine endometrial stromal cells, in terms of gene expression patterns. Basing on preliminary data obtained through RNA sequencing analysis (RNAseq), it was noticed that several genes are up-regulated after BoHV-4 infection and that, among these genes, Metalloproteinase 1 is one of the most relevant, because of its possible implication in the development of bovine endometritis. Subsequent analysis elicited by western-blot and real time techniques, were able to corroborate these results, underlying the efficiency of a new experimental approach, based on RNAseq technology, for the study of the onset of pathologies.