Analisi dell’attività antimicrobica e antivirale dei prodotti di geni codificanti gli anticorpi

Abstract

Il progetto si è proposto di selezionare peptidi e/o proteine codificati da geni coinvolti nella sintesi degli anticorpi (Ab) che possiedano attività biologiche d’interesse, quali attività antimicrobica ed antivirale, e di indagare il loro possibile meccanismo d’azione. In particolare alcuni peptidi oggetto di studio di lavori precedenti, derivati da differenti frammenti corrispondenti ai CDR (complemetarity determining regions) degli Ab e molti decapeptidi, rappresentanti la regione variabile di un Ab anti-idiotipico ricombinante immagine interna di una tossina killer di lievito, avevano mostrato una significativa attività fungicida in vitro e in vivo nei confronti di Candida albicans (Polonelli L. et al. Infect. Immun. 2003; Polonelli L. et al. PLoS ONE 2008). Il frammento più attivo sia in vivo che in vitro, chiamato P6, è stato mutagenizzato sostituendo il primo residuo amminoacidico con una alanina, ottenendo un peptide killer (KP), caratterizzato da una incrementata attività in vitro e terapeutica in vivo nei confronti di candidosi vaginale e sistemica, criptococcosi e paracoccidomicosi (Polonelli L. et al. Infect. Immun. 2003; Cenci E. et al. Cell. Microbiol. 2004; Travassos L.R. et al. J. Antimicrob. Chemoter. 2004). KP ha, inoltre, mostrato attività antivirale sia nei confronti del virus influenzale A che di HIV (Casoli C. et al. AIDS 2006; Conti G. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2008). Successivamente, peptidi Fc, derivati da frammenti comuni a diversi tipi di Ab, ipoteticamente prodotti per azione di proteasi fisiologiche, si sono mostrati fungicidi in vitro nei confronti di diversi lieviti patogeni, inclusi ceppi resistenti a caspofungina e triazoli, ed hanno mostrato attività terapeutica in modelli murini di candidosi vaginale e sistemica (Polonelli L. et al. PLoS ONE 2012). L’evidenza che l’attività biologica di tali peptidi sembra essere totalmente indipendente dalla regione anticorpale da cui derivano, ha permesso di ipotizzare che gli Ab possano costituire un serbatoio inesauribile di peptidi ad elevata attività antimicrobica, suggerendo lo sviluppo di nuovi studi basati su un approccio del tipo “dal genoma alla proteina”. Sulla base dei risultati ottenuti precedentemente e delle esperienze tecnico-informatiche acquisite, in questo progetto di Dottorato ci si è proposti di selezionare nuovi peptidi e/o proteine di derivazione anticorpale con attività biologica, sulla base delle sequenze proteiche codificate da geni appartenenti alla famiglia delle immunoglobuline (in particolare, geni V, D e C per la catena leggera e V, D, J e C per la catena pesante) presenti nelle banche dati disponibili. Alcuni dei peptidi selezionati hanno mostrato un’interessante attività antimicrobica nei confronti di diversi ceppi fungini e batterici, anche caratterizzati da diverse resistenze ai farmaci convenzionali, in vivo nei confronti di candidosi sperimentale in larve di Galleria mellonella, la comune camola del miele, e di esplicare attività antitumorale in vitro ed in vivo nei confronti di cellule di melanoma. Esperimenti preliminari condotti nei confronti di HIV-1 hanno mostrato una scarsa attività dei peptidi, nelle condizioni sperimentali adottate. I peptidi non sono risultati in alcun modo tossici nei confronti delle cellule trattate, come dimostrato mediante saggi di vitalità, emolisi e genotossicità, e saggi di citofluorimetria hanno escluso la possibilità che possano indurre apoptosi. Inoltre, studi di microscopia confocale hanno permesso di rilevare che i peptidi penetrano molto rapidamente nelle cellule fungine (dato confermato anche da saggi di time-killing) localizzandosi preferenzialmente in una particolare zona prima di diffondere omogeneamente. Studi di microscopia a scansione hanno permesso di rilevare cellule completamente distrutte già dopo un’ora di trattamento, mentre studi di microscopia a trasmissione hanno evidenziato la presenza nelle cellule di lievito di strutture definibili come microbodies o perossisomi, precedentemente descritte in tali cellule anche in seguito a stress ossidativo. Tale osservazione sembra confermata anche da esperimenti che hanno evidenziato la capacità dei peptidi di indurre la formazione di specie reattive dell’ossigeno. Studi di dicroismo circolare hanno mostrato che i peptidi in soluzione assumono una conformazione random coil stabile, mentre l’aggiunta di sodio dodecil solfato (un mimotopo dei fosfolipidi di membrana) determina una riorganizzazione in una struttura simile ad una α-elica. In presenza di lipopolisaccaride o laminarina i peptidi subiscono cambiamenti strutturali indicativi di una possibile interazione con la membrana esterna dei batteri Gram negativi o con la parete fungina. E’ stato possibile identificare peptidi e/o proteine o loro derivati ingegnerizzati, che potrebbero essere sfruttati per lo sviluppo di nuovi farmaci per terapie innovative e più efficaci. La comprovata attività antimicrobica di alcuni peptidi, quali prodotti di geni codificanti gli Ab, consentirebbe ulteriori speculazioni, più concettuali ma molto intriganti, a supporto di una ipotesi evoluzionistica secondo la quale gli Ab potrebbero essere il risultato dell’associazione e della combinazione di peptidi e proteine che in origine possedevano una funzione biologica aspecifica. L’associazione di molecole ad attività aspecifica, nel corso dell’evoluzione, potrebbe aver dato origine a molecole ad attività altamente specifica, quali gli Ab, consentendo di ipotizzare una ulteriore forte correlazione tra immunità innata ed adattativa.

The aim of the project was to select peptides and/or proteins encoded by the genes involved in the synthesis of antibodies (Ab) that possess biological activities of interest, such as antimicrobial and antiviral activities, and to investigate their possible mechanism of action. In particular, some peptides object of previous studies, derived from different fragments corresponding to the CDR (complemetarity determining regions) of Ab and many decapeptides, spanning the variable region of a recombinant anti-idiotypic Ab internal image of a yeast killer toxin, showed a significant fungicidal activity in vitro and in vivo against Candida albicans (Polonelli L. et al. Infect. Immun. 2003; Polonelli L. et al. PLoS ONE 2008). The most active fragment both in vivo and in vitro, called P6, was mutagenized by replacing the first amino acid residue with alanine, resulting in a killer peptide (KP),, characterized by an increased activity in vitro and an enhanced therapeutic effect in vivo against vaginal and systemic candidiasis, cryptococcosis and paracoccidomicosis (Polonelli L. et al. Infect. Immun. 2003; E. Cenci et al. Cell. Microbiol. 2004; Travassos L.R. et al. J. Antimicrob. Chemoter. 2004). KP also showed antiviral activity against both the influenza A virus and HIV (Casoli C. et al. AIDS 2006; Conti G. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2008). In addition, Fc peptides, derived from fragments common to different types of Ab, hypothetically produced for physiological action of proteases, showed fungicidal activity in vitro against a number of pathogenic yeasts, including strains resistant to caspofungin and triazoles, and exerted a therapeutic activity in murine models of vaginal and systemic candidiasis (Polonelli L. et al. PLoS ONE 2012). The evidence that the biological activity of these peptides seems to be totally independent from the Ab region from which they are derived, has allowed us to hypothesize that Abs may constitute an inexhaustible source of peptides with antimicrobial activity, suggesting the development of new studies based on the approach “from the genome to the protein”. On the basis of the results obtained previously and the technical-computing experiences acquired, the aim of this Doctoral project was to select new peptides and/or proteins derived from Ab with biological activity, based on the protein sequences encoded by genes belonging to the family of immunoglobulins (in particular, gene V, D and C for the light chain and V, D, J, and C for the heavy chain) present in available databases. Some of the selected peptides showed an in vitro interesting antimicrobial activity against several fungal and bacterial strains, also characterized by different resistances to conventional drugs, in vivo against experimental candidiasis in larvae of Galleria mellonella, the common moth honey, and exert antitumor activity in vitro and in vivo towards melanoma cells. Preliminary experiments carried out against HIV-1 showed a low activity of the peptides, in the adopted experimental conditions. The peptides were not toxic at all against the treated cells, as demonstrated by vitality, hemolysis and genotoxicity assays, and flow cytometry ruled out the possibility that they may induce apoptosis. Moreover, confocal microscopy studies allowed to detect that the peptides penetrate very quickly in fungal cells (which is also confirmed by time-killing assays) localizing preferentially in a particular area before spreading homogeneously into the cell. Studies of scanning microscopy allowed the detection of completely destroyed cells after only one hour of treatment, while transmission microscopy studies showed the presence in the yeast cells of structures as microbodies or peroxisomes, previously described in these cells even after oxidative stress. This observation seems to be confirmed also by experiments which showed the ability of the peptides to induce reactive oxygen species. Circular dichroism studies showed that the peptides in solution assume a stable random coil conformation, while the addition of sodium dodecyl sulphate (a mimotope of membrane phospholipids) determines a reorganization in a structure similar to an α-helix. In the presence of lipopolysaccharide or laminarin, the peptides undergo structural changes indicative of a possible interaction with the outer membrane of Gram-negative bacteria or with the fungal wall. It has been possible to identify peptides and/or proteins or their engineered derivatives, that could be exploited for innovative and more effective treatments. The proven antimicrobial activity of some peptides, such as the products of genes encoding the Abs, would allow a further speculation, more conceptual but very intriguing, in support of an evolutionary hypothesis according to which the Abs may be the result of the association and of the combination of peptides and proteins that originally possessed a nonspecific biological function. So, the association of molecules with nonspecific activity, during evolution, may have given rise to molecules with highly specific activities, such as Abs, allowing to hypothesize a further strong correlation between innate and adaptive immunity.