Over-expression of pro-osteoclastogenic cytokine receptors and chemokines by bone marrow CD14+ monocytes of Multiple Myeloma (MM) patients as compared to Smoldering MM (SMM) and Monoclonal Gammopathy of Uncertain Significance (MGUS): role of IL-21R/IL-21 axis in MM-induced osteoclastogenesis.

Abstract

Multiple myeloma (MM) is characterized by the uncoupled increase in bone marrow (BM) of osteoclast formation and activation, which lead to bone destruction, as compared to patients with smoldering MM (SMM) and monoclonal gammopathy of uncertain significance (MGUS). Although the molecular analysis of clonal plasma cells (PCs) identified several genes whose overexpression is associated with the occurrence of bone lesions, a clear transcriptional fingerprint able to distinguish the different PC dyscrasias is lacking. As the close relationship between PCs and BM microenvironment plays a pivotal role in MM pathogenesis, ongoing studies are focusing on the presence of potential molecular alterations in the microenvironment. Among the different cell types of BM microenvironment, monocytes are known to be primarily involved in osteoclastogenesis, angiogenesis and immune function. The aim of this study was to analyze the transcriptional and proteomic profiles of the BM CD14+ cells across the different types of monoclonal gammopathies and to identify alterations potentially involved in the pathogenesis of the increased osteoclastogenesis. The expression profiles of CD14+ samples were evaluated by Affymetrix GeneChip HG-U133Plus 2.0 arrays in 25 MM, 11 SMM and 8 MGUS patients. The proteomic analysis of CD14+ cells of 5 MM, 5 SMM and 5 MGUS was run on Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer (Thermo Scientific) and the data analyzed with Proteome Discoverer 1.4 software. A multiclass analysis identified 18 differentially expressed genes in MGUS, SMM and MM. The comparison of MM with both SMM and MGUS samples identified 61 genes differentially expressed in CD14+ cells (37 up-regulated and 24 down-regulated). Interestingly, we found specific cytokine receptors (IL21R and IL-15R) and pro-osteoclastogenic chemokines (CXCL10) that were over-expressed in CD14+ of MM patients, as compared to SMM and MGUS. Similarly, the proteomic analysis reinforced that different CD14+ monocyte protein profiles were found comparing MM patients with MGUS and SMM ones. Interestingly, MM monocytes over-expressed proteins involved in cell adhesion and inflammation and down-regulated molecules implicated in antimicrobial functions. Because recent data indicate that IL-21 is a growth factor for MM cells and may promote osteoclastogenesis in some pathological conditions such as rheumatoid arthritis, we further investigate the potential role of IL-21R over-expression by MM CD14+ cells in osteoclastogenesis. Firstly, we confirmed the IL-21R up-regulation by CD14+ of MM patients at both mRNA and protein level as compared to both SMM and MGUS. On the other hand any significant difference was not observed in the BM plasma IL-21 levels between MM, SMM and MGUS. The treatment with rhIL-21, at the concentration observed in the BM plasma, increased the size of osteoclasts in CD14+-derived in vitro osteoclastogenesis assays, in MM patients but not in SMM and MGUS; this suggested higher sensitivity to the IL-21-dependent pro-osteoclastogenic differentiation effect in MM patients. Finally the overexpression of IL-21R by lentiviral vectors, as well as the use of an IL-21R signaling inhibitor, was analyzed in our in vitro model to delineate a new anti-osteoclastogenic strategy. In conclusion our results indicate that different expression fingerprints characterize BM CD14+ monocytes of patients with MM as compared to those with SMM and MGUS, including over-expression of IL-21R, putatively involved in MM-induced osteoclast formation and activation through an increased sensitivity to IL-21.

Il mieloma multiplo (MM) è caratterizzato da un rimodellamento osseo alterato, con aumento del numero e dell’attività degli osteoclasti, che portano alla distruzione ossea, rispetto ai pazienti con smoldering MM (SMM) e gammopatia monoclonale di significato incerto (MGUS). Sebbene l'analisi molecolare delle plasmacellule (PC) clonali abbia identificato diversi geni la cui over-espressione è associata con la presenza di lesioni ossee, non è ancora stato identificato un profilo in grado di distinguere tra loro, in modo chiaro, le diverse discrasie plasmacellulari. Dal momento che la stretta relazione tra PC e microambiente midollare gioca un ruolo fondamentale nella patogenesi del MM, attualmente diversi gruppi di ricerca si sono focalizzati sullo studio della presenza di eventuali alterazioni molecolari presenti nel microambiente midollare. Tra i diversi tipi di cellule che compongono il microambiente midollare, i monociti sono noti per essere primariamente coinvolti nei processi di osteoclastogenesi, angiogenesi e funzione immunitaria. Lo scopo di questo studio è stato quello di analizzare i profili trascrizionali e proteomici dei monociti CD14+ midollari dei diversi tipi di gammopatie monoclonali e di identificare le alterazioni potenzialmente coinvolte nella patogenesi dell’osteoclastogenesi indotta da MM. I profili di espressione delle cellule CD14+ sono stati valutati attraverso array GeneChip HG-U133Plus 2.0 su piattaforma Affymetrix, utilizzando campioni ottenuti da 25 pazienti affetti da MM, 11 SMM e 8 MGUS. L'analisi proteomica dei monociti midollari è stata invece eseguita con lo spettrometro di massa Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer (Thermo Scientific) ed il software Proteome Discoverer 1.4, utilizzando monociti provenienti da 5 MM, 5 SMM e 5 MGUS. L’analisi multiclasse dei profili di espressione genica dei monociti midollari ha identificato 18 geni differenzialmente espressi in MGUS, SMM e MM. Il confronto delle cellule CD14+ di MM con le forme indolenti (SMM e MGUS), ha identificato 61 geni differenzialmente espressi (37 up-regolati e 24 down-regolati). Tra questi geni, abbiamo trovato recettori (IL-21R e IL-15R) e chemochine pro-osteoclastogeniche (CXCL10) che risultano over-espressi nei monociti CD14+ dei pazienti con MM, rispetto a SMM e MGUS. Analogamente, l'analisi proteomica ha identificato diversi profili per i monociti dei pazienti con MM rispetto alle forme indolenti. È interessante notare che, i monociti di MM over-esprimono proteine coinvolte nell’adesione cellulare e nell'infiammazione, e molecole implicate in funzioni antimicrobiche. Poiché i dati recenti di letteratura indicano che IL-21 è un fattore di crescita per le cellule di MM e può promuovere l’osteoclastogenesi in alcune condizioni patologiche come l'artrite reumatoide, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sul ruolo potenziale dell’asse IL-21/IL-21R nell’osteoclastogenesi indotta da MM. In primo luogo, abbiamo confermato l’over-espressione di IL-21R da parte dei monociti di MM, sia a livello di mRNA che di proteina, rispetto a SMM e MGUS. D'altra parte, non è stata trovata una differenza significativa nei livelli plasmatici midollari di IL-21 tra MM, SMM e MGUS. Il trattamento con IL-21 ricombinante umana, alla concentrazione osservata nei plasmi midollari, determina un aumento delle dimensioni degli osteoclasti in esperimenti di osteoclastogenesi in vitro, a partire da precursori ottenuti dal midollo di pazienti con MM ma non con SMM e MGUS. Questo dato suggerisce una maggiore sensibilità all'effetto pro-osteoclastogenico di IL-21 dei pazienti affetti da MM. Infine, abbiamo testato, nel nostro modello in vitro, l’over-espressione di IL-21R attraverso vettori lentivirali, nonché l'uso di un inibitore della via di segnalazione di IL-21, per delineare una nuova strategia anti-osteoclastogenica per il MM. In conclusione i nostri risultati indicano che i monociti midollari dei pazienti con MM, rispetto a quelli con SMM e MGUS, sono caratterizzati da diversi profili sia trascrizionali che proteomici, tra cui l’over-espressione di IL-21R, putativamente coinvolta nella formazione degli osteoclasti MM-indotta.