Glutamine availability as a target for the control of Glutamine-Synthetase negative human cancers: the case of oligodendroglioma

Abstract

The amino acid Glutamine (Gln) is a nutrient of fundamental importance for cell metabolism. It is involved in many metabolic pathways, such as the synthesis of non essential amino acids, nucleotides and hexosamines, the regulation of cell volume, the response to oxidative stress (through the maintenance of intracellular glutathione). Moreover, it refuels the Krebs cycle with carbon moieties (anaplerosis) and activates mTOR, possibly through the energization of leucine influx. It has been known since many years that several types of normal and cancer cells depend upon Gln availability to maintain adequate proliferative activity. Moreover, certain cancer cells require large amounts of Gln and undergo severe metabolic stress and apoptosis upon Gln restriction, a condition called “Gln addiction”. However, the molecular basis of Gln addiction and, more in general, the molecular and metabolic features that underlie the sensitivity to Gln depletion have not yet been defined. The impossibility to identify Gln-dependent tumors has hampered, until now, the possibility to exploit sensitivity to Gln depletion for therapeutic purposes. However, a drug that produces Gln depletion in plasma has an established clinical use for many years. This drug, L-asparaginase (ASNase), is one of the first-line agents for the therapy of Acute Lymphoblastic Leukemia, since it produces a marked depletion of plasma asparagine, which ALL blasts cannot synthetize. However, ASNase also produces a partial depletion of plasma Gln. This thesis aims at identifying determinants of Gln sensitivity in human cancer cells, using the sensitivity to ASNase as a device of potential translational interest. The cancer model adopted in this study is oligodendroglioma. Oligodendrogliomas are rare brain cancers, which are often characterized by lack of expression of Glutamine Synthetase (GS negativity). The hypothesis of the study is, therefore, that low GS expression may render oligodendroglioma cells particularly dependent upon external Gln. For verifying this hypothesis, the effects of the ASNase from Erwinia chrysanthemi, the most glutaminolytic variant in clinical use, were compared in two different human oligodendroglioma lines, HOG and Hs683, and in two glioblastoma cell lines, U87 and U373. Compared to glioblastoma cells, oligodendroglioma cells expressed far lower amount of the mRNA of GLUL, the gene which encodes for GS. Consistently, GS protein expression was readily detectable in U87 and in U373 cells, but not in HOG and Hs683 cells, remaining undetectable even after ASNase treatment, a condition known to increase GS abundance in other cell models. Under the same condition, GS expression was instead clearly increased in glioblastoma lines. Upon ASNase treatment, a marked depletion of cell Gln was detected in all the cell models. However, while HOG and Hs683 underwent an almost complete suppression of cell viability, glioblastoma lines were less sensitive. Moreover, the IC50 values for ASNase were lower in oligodendroglioma than in glioblastoma cells. The addition of the GS inhibitor methionine-L-sulfoximine (MSO) did not synergize ASNase effects in oligodendroglioma cells, while enhanced the effect of ASNase in U87 and U373 glioblastoma cells, confirming the absence of a functional GS in the former cell models. Moreover, HOG and Hs683 cells were more dependent than glioblastoma cells on the availability of extracellular Gln. These results consistently point to a relationship between lack of GS and dependence on extracellular Gln. Nevertheless, transfection experiments with GLUL in HOG and Hs683 cells, while produced a marked GS expression in transfected oligodendroglioma cells, failed to yield a significant protection from Gln deprivation. This result may suggest that the severe consequences of Gln depletion in oligodendroglioma cells are not the result of the sole poor GS expression. Definite conclusions would require the measurement of Gln content along with the determination of GS activity in GLUL-transfected cells. However, further support to the dependence of oligodendroglioma cells from extracellular Gln has come from studies on Gln transporters. Gln is transported into mammalian cells by several transport systems. Most of Gln influx is due to sodium-dependent transporters belonging to the SLC1 (ASCT transporters) and SLC38 (SNAT transporters) gene families. In particular, ASCT2, the product of the SLC1A5 gene, appears overexpressed in several tumors and in many models of Gln-addicted cancer cells in vitro. A preliminary characterization of Gln-transporter expression in oligodendroglioma cells indicated that these cells express members of both SLC1 and SLC38 families and, in particular, Hs683 cells showed high expression of the SNAT1 transporter. In the attempt to hinder the activity of these transporters and, hence, Gln transport, oligodendroglioma and glioblastoma cells were incubated in the presence of high concentrations of specific inhibitors. The results indicated that transport inhibition had larger inhibitory effects on the viability of oligodendroglioma cells, compared with glioblastoma cells. In particular, both HOG and Hs683 cells were very sensitive to the specific inhibitor of SNAT transporters 2-methylaminoisobutyric acid (MeAIB). These results suggest that oligodendroglioma cells depend upon this transporter for Gln fuelling. In the attempt to verify if the cytotoxic effects of Gln depletion were due to the inhibition of mTOR, the activity of the kinase was also studied in oligodendroglioma and glioblastoma cells. While ASNase caused a severe inhibition of the kinase activity in HOG cells (as well as in glioblastoma cells), mTOR activity was spared in Hs683 cells. However, both HOG and Hs683 cells exhibited a very low mTOR activity when incubated in amino acid-free saline solution, indicating that sensitivity to essential amino acids, such as leucine, is maintained in both models. Gln restitution to cells pre-incubated in amino acid free saline solution restored mTOR activity in HOG but not in Hs683 cells. Hs683 cells also exhibited enhanced sensitivity to the mTORC1 inhibitor rapamycin, thus showing a mTOR-dependent phenotype. This behavior is probably to attribute to a MTOR mutation, previously described in these cells, that constitutively increases the phosphorylation of the mTOR substrate S6K1. While these results exclude that mTOR inhibition plays a role in the cytotoxic effects of ASNase in oligodendroglioma cells, they indicate that Hs683 cells yield a model of Gln-independent mTOR and demonstrate that leucine and Gln have independent roles in the stimulation of mTOR. In summary, the results recounted in this thesis indicate that GS-negative oligodendroglioma cells are markedly dependent on extracellular Gln and that mTOR inhibition is not involved in the effect. Lack of significant GS expression may, therefore, constitute a marker of sensitivity to therapeutic approaches based on the reduced availability of the amino acid. This hypothesis awaits conclusive confirmation in vivo with models of oligodendroglioma and, possibly, other GS-negative tumors.

L'aminoacido glutammina (Gln) è un nutriente di fondamentale importanza per il metabolismo cellulare. E’ coinvolto, infatti, in molte vie metaboliche, come la sintesi di aminoacidi non essenziali, nucleotidi ed esosamine, la regolazione del volume cellulare e la risposta allo stress ossidativo (attraverso il mantenimento dei livelli intracellulari di glutatione). Inoltre, rifornisce il ciclo di Krebs di intermedi carboniosi (anaplerosi) ed è coinvolta nell’attivazione di mTOR (anche facilitando l’ingresso di leucina). È noto da molti anni che diversi tipi di cellule normali e tumorali dipendono dalla disponibilità di Gln extracellulare per mantenere un'adeguata attività proliferativa. Inoltre, alcune cellule tumorali richiedono grandi quantità di Gln e subiscono un grave stress metabolico, che esita in apoptosi, quando sono incubate in condizioni di ridotta disponibilità dell’aminoacido. Questa condizione viene denominata "dipendenza da Gln" (glutamine addiction). Le caratteristiche molecolari e metaboliche che sono alla base della dipendenza da Gln non sono ancora precisamente definite. L’incompleta conoscenza delle basi della dipendenza da Gln ha ostacolato lo sfruttamento a fini terapeutici di farmaci che riducono la disponibilità dell’aminoacido. Una parziale eccezione è rappresentata dalla L-asparaginasi (ASNasi), uno dei farmaci di prima linea per la terapia della leucemia linfoblastica acuta. Questo enzima produce una marcata deplezione di asparagina, che i blasti leucemici non possono sintetizzare, ma causa anche una transitoria caduta dei livelli plasmatici di Gln. Questa tesi si propone di identificare caratteristiche metaboliche di cellule tumorali umane associate a Gln-dipendenza nei tumori umani, usando il trattamento con ASNasi come condizione sperimentale di possibile interesse traslazionale. Il modello di cancro adottato in questo studio è l’oligodendroglioma. Gli oligodendrogliomi sono tumori cerebrali rari, che sono spesso caratterizzati da assenza di espressione di Glutamina Sintetasi (GS), l’enzima che provvede alla sintesi intracellulare di Gln a partire da Glu e NH4+. L'ipotesi sperimentale è che la bassa espressione di GS possa rendere le cellule di oligodendroglioma particolarmente dipendenti dalla Gln extracellulare e, quindi, sensibili al trattamento con ASNasi. Per verificare questa ipotesi, gli effetti di ASNasi da Erwinia chrysanthemi, la variante con maggiore attività glutaminolitica in uso clinico, sono stati studiati in due diverse linee di oligodendroglioma umani, HOG e Hs683, e in due linee cellulari di glioblastoma, U87 e U373. Le cellule di glioblastoma esprimevano livelli molto più alti di mRNA per GLUL (il gene che codifica GS) rispetto alle cellule di oligodendroglioma. L’espressione proteica di GS era facilmente accertabile nelle cellule U87 e U373, ma non nelle cellule HOG e Hs683, rimanendo non rilevabile anche dopo il trattamento con ASNasi, una condizione che, nelle cellule di glioblastoma, causa un netto aumento di espressione di GS. In seguito al trattamento con il farmaco una marcata deplezione di Gln intracellulare è stata rilevata in tutti i modelli cellulari. Il trattamento con ASNasi causava una quasi totale perdita di vitalità nelle colture di cellule HOG e Hs683 ma non nelle U87 e nelle U373. Inoltre la IC50 per ASNasi era più bassa nelle cellule di oligodendroglioma che nelle cellule di glioblastoma. L'inibitore di GS metionina-L-sulfoximina (MSO) aumentava l'effetto dell’ASNasi nelle cellule di glioblastoma ma non sinergizzava gli effetti del farmaco nelle cellule di oligodendroglioma, confermando l’assenza di una significativa attività di GS in questo modello. Le cellule HOG e Hs683 erano inoltre più dipendenti rispetto alle cellule di glioblastoma dalla disponibilità di Gln extracellulare. Questi risultati suggeriscono che la ridotta espressione di GS renda le cellule di oligodendroglioma dipendenti dalla Gln extracellulare. Tuttavia, esperimenti di trasfezione delle cellule HOG e Hs683 con GLUL hanno prodotto un’elevata espressione di GS nelle cellule di oligodendroglioma trasfettate ma non hanno portato ad una protezione significativa dagli effetti citototossici della deprivazione di Gln. Questo risultato può suggerire che la scarsa espressione di GS non sia l’unico fattore alla base dei gravi effetti citotossici della deplezione di Gln, ma conclusioni definitive richiederanno la misurazione del contenuto intracellulare di Gln nelle diverse condizioni, insieme alla determinazione dell'attività di GS nelle cellule trasfettate con GLUL. Comunque, ulteriori evidenze sperimentali a supporto della marcata dipendenza dalla Gln extracellulare delle cellule di oligodendroglioma sono state ottenute da studi riguardanti i trasportatori di Gln. Nelle cellule dei mammiferi Gln è trasportata da diversi sistemi di trasporto; tuttavia, la maggior parte del rifornimento di Gln al metabolismo cellulare è assicurata da trasportatori sodio-dipendenti delle famiglie geniche SLC1 (trasportatori ASCT) e SLC38 (trasportatori SNAT). In particolare, ASCT2, il prodotto del gene SLC1A5, è sovraespresso in molti tumori e in molti modelli di cellule tumorali Gln-dipendenti. Una caratterizzazione preliminare dell’espressione dei trasportatori di Gln nelle cellule di oligodendroglioma ha indicato che queste cellule esprimono membri di entrambe le famiglie SLC1 e SLC38. In particolare, le cellule Hs683 esprimono elevati livelli del mRNA per il trasportatore SNAT1. Per ostacolare l'attività di questi trasportatori e, di conseguenza, ridurre il trasporto di Gln nel compartimento intracellulare, le cellule di oligodendroglioma e glioblastoma sono state incubate in presenza di elevate concentrazioni di inibitori di questi sistemi. I risultati hanno indicato che l'inibizione del trasporto ha avuto maggiori effetti inibitori sulla vitalità delle cellule di oligodendroglioma che delle cellule di glioblastoma. In particolare, sia le cellule HOG e Hs683 erano molto sensibili all’ acido 2-metilaminoisobutirrico (MeAIB), l’inibitore specifico dei trasportatori SNAT. Questi risultati suggeriscono che nelle cellule di oligodendroglioma il rifornimento di Gln dipende da questo trasportatore e confermano la loro dipendenza dalla Gln extracellulare. Nel tentativo di verificare se gli effetti citotossici della deplezione di Gln fossero dovuti alla inibizione di mTOR, l'attività della chinasi è stata studiata nelle cellule di oligodendroglioma e glioblastoma. Mentre ASNasi causava una grave inibizione dell'attività della chinasi nelle cellule HOG, così come nelle cellule di glioblastoma, l'attività di mTOR non risultava inibita nelle cellule Hs683. Tuttavia, l’attività di mTOR risultava completamente soppressa in entrambe le cellule HOG e Hs683 in seguito all’ incubazione in una soluzione salina senza aminoacidi, indicando che in entrambi i modelli l’attività della chinasi è sensibile agli amino acidi essenziali, come la leucina. Il ripristino della concentrazione extracellulare di Gln ha riattivato l'attività di mTOR nelle cellule HOG, ma non nelle Hs683. Le cellule Hs683 esibivano anche una maggiore sensibilità all’inibitore di mTORC1 rapamicina, mostrando quindi un fenotipo mTOR-dipendente. Questo comportamento è probabilmente da attribuire a una mutazione del gene MTOR, precedentemente descritta in queste cellule, che aumenta costitutivamente la fosforilazione del substrato della chinasi S6K1. Mentre questi risultati escludono che l'inibizione di mTOR possa giocare un ruolo sugli effetti citotossici di ASNasi nelle cellule di oligodendroglioma (dato il diverso comportamento delle HOG e delle Hs683), essi indicano anche che le cellule Hs683 costituiscono un interessante modello in cui mTOR è Gln-indipendente e dimostrano che leucina e Gln hanno ruoli indipendenti nella stimolazione di mTOR. Riassumendo, i risultati descritti in questa tesi indicano che cellule di oligodendroglioma GS-negative sono estremamente dipendenti dalla Gln extracellulare e che l’inibizione di mTOR non è coinvolta in questo effetto. La mancanza di una significativa espressione di GS può pertanto costituire un marker di sensibilità per approcci terapeutici basati sulla riduzione della disponibilità di Gln. Questa ipotesi attende una conferma sperimentale in modelli sperimentali di oligodendroglioma ed, eventualmente, di altri tumori GS-negativi.