La Nutlin-3 potenzia l’effetto citotossico del trattamento combinato con gli inibitori di MEK1 e l’arsenico triossido in cellule di Leucemia Acuta

Abstract

Nelle cellule primarie di Leucemia Mieloide Acuta (AML), il pathway Ras/Raf/MAPK è spesso costitutivamente attivato, conferendo alle cellule vantaggi in termini di sopravvivenza e proliferazione; il blocco di MEK inibisce crescita e proliferazione cellulare e down-regola l’espressione di numerosi fattori anti-apoptotici, riducendo così la soglia apoptotica; tuttavia il blocco di MEK rende le cellule leucemiche sensibili, in maniera efficiente e selettiva, a dosi sub-ottimali di numerosi agenti anticancro, sia convenzionali che innovativi. Proprio in questo contesto è stato dimostrato che inibitori di MEK (PD184352, PD98059, PD325901) sensibilizzano blasti primari AML all’apoptosi indotta da Triossido di Arsenico (ATO) via p73, paralogo di p53, e l’attivazione del pathway pro-apoptotico di Bad. Inoltre è stato anche dimostrato che alte dosi di ATO (2microM) inducono l’accumulo di p53, con un incremento di più del doppio rispetto al controllo, in 11 su 21 pazienti (52%), indicando un possibile contributo del pathway di p53 nell’induzione dell’apoptosi in seguito al trattamento combinato PD+ATO sui blasti. Mutazioni di TP53 sono piuttosto rare in AML (5-10%) e MDM2 (murine double minute 2), il suo principale gene regolatore, è frequentemente stato trovato overespresso in AML, processo questo che può aumentare attivamente il potenziale tumorigenico e la resistenza all’apoptosi. Dato che, in cellule AML, gli inibitori di MEK possono aumentare la funzione proapoptotica nucleare di p53 oltre a quella di p73, lo scopo di questo studio è stato quello di investigare se la Nutlin-3, una piccola molecola antagonista di MDM2, potente e selettiva, poteva potenziare l’effetto apoptotico degli inibitori di MEK in combinazione con ATO, nelle cellule AML che overesprimono MDM2 e con p53 wild type. L’apoptosi è stata valutata tramite saggi di misurazione del contenuto di DNA Sub-G1, legame con annessina V e valutazione del potenziale mitocondriale transmembrana. Abbiamo prima analizzato le interazioni farmacologiche tra Nutlin-3, PD e ATO (0, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, or 10 micro M) usando una fixed-ratio (1:1:1 o 1:2:4) su cellule AML OCI-AML-3 e MOLM-13, entrambe con una p53 wild-type. Abbiamo osservato che la combinazione dei tre farmaci (NUT/PD/ATO) ha mostrato un più forte sinergismo citotossico rispetto alla combinazione PD/ATO indicando che l’inibizione dell’interazione tra p53 e MDM2, mediata dalla Nutlin-3, può influenzare positivamente l’effetto pro-apoptotico delle cellule trattate con PD e ATO: l’indice di combinazione medio (CI) calcolati dall’ED50 (50% effective dose), ED75 e ED90, con NUT/PD/ATO rispetto a cellule trattate con PD/ATO è 0.36± 0.03 contro 0.72±0.02 e 0.28±0.11 contro 0.50±0.15 rispettivamente per le OCI-AML-3 e per le MOLM-13. Al fine di indagare gli effettori molecolari coinvolti nell’apoptosi indotta da Nultina/PD/ATO o da PD/ATO, abbiamo inizialmente studiato la cinetica di p53, p73 a 2, 12, 24, e 48 ore nelle cellule OCI-AML-3 e MOLM-13. In assenza di Nutlin-3, ATO, anche ad alte dosi, non promuoveva un accumulo di p53 mentre modulava l’espressione genica di p73 attraverso l’induzione del isoforma pro-apoptotica e anti-proliferativa TAp73, e delle isoforma anti-apoptotica e pro-proliferativa ΔNp73, mantenendo in questo modo inalterato il rapporto TA/ ΔNp73. Al contrario, il trattamento con PD riduceva i livelli di ΔNp73 e fermava l’up-regolazione ATO mediata di ΔNp73 causando così un incremento del rapporto TA/ΔNp73 nelle cellule sottoposte a doppio trattamento (PD/ATO). In particolare, in cellule AML trattate con PD/ATO, l’aggiunta di Nutlin-3 non solo aumenta i livelli della proteina p53 ma anche induceva una forte riduzione di ΔNp73, dominante negativo di p53 wild-type e TAp73, portando ad un aumento di espressione dei geni target di p73/p53 come P53AIP1 e Puma e la perdita del potenziale di membrana mitocondriale. Infine, abbiamo dimostrato che la Nutlin-3 aumentava significativamente l'attività antileucemica del PD/ATO nella maggior parte dei blasti leucemici provenienti da 14 diversi casi di AML analizzati ex vivo. Nel complesso questi risultati suggeriscono che il pathway pro-apoptotico p73, coinvolto nell’efficacia del trattamento PD/ATO, può essere potenziato dall’attivazione del pathway p53 in cellule AML che possiedono un pathway p53 funzionale e fornisce una spiegazione razionale per una effettiva e relativamente specifica strategia terapeutica per la AML.

In primary acute myelogenous leukemia (AML) cells, the growth-stimulating Ras/Raf/MAPK pathway is frequently constitutively activated conferring to leukemic cells a proliferative and survival advantages; MEK blockade inhibits cell growth and proliferation and downregulates the expression of several anti-apoptotic players, thereby lowering the apoptotic threshold; Nevertheless, MEK blockade efficiently and selectively sensitizes leukemic cells to sub-optimal doses of numerous conventional and investigational anticancer agents. In this context it has been reported that MEK inhibitors (PD184352, PD98059, PD325901) sensitize primary AML blasts to arsenic trioxide (ATO)-induced apoptosis via p73, a p53 paralogue, and Bad pro-apoptotic pathways activation. It also has been demonstrated that high doses of ATO (2microM) induced p53 accumulation (more than two-fold increase compared with control) in 11 out of 21 patients (52%), indicating a possible contribution of p53 pathway in apoptosis induction of dual treated blasts. TP53 mutations are quite rare in AML (5-10%) and MDM2 (murine double minute 2), its principal negative regulator, has been found to be frequently overexpressed in AML, a process that can actively enhance tumorigenic potential and resistance to apoptosis. Because, in AML cells, MEK inhibitors may enhance nuclear proapoptotic function of p53 other than p73 pathway, the aim of this study was to investigate whether Nutlin-3, a potent and selective small-molecule MDM2 antagonist, can potentiate the apoptotic effect of mek inhibitors plus ATO combination in AML cells overexpressing MDM2 and wild type p53. Apoptosis was evaluated, by measurement of sub-G1 DNA content, annexin V binding and mitochondrial transmembrane potential assays. We first analyzed the pharmacologic interactions between Nutlin-3, PD and ATO (0, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, or 10 micro M) using a fixed-ratio (1:1:1 or 1:2:4) experimental design in OCI-AML-3 and MOLM-13 AML cell lines, both having wild-type p53. We found that the three-drugs combination (NUT/PD/ATO) showed cytotoxic synergism stronger than PD plus ATO combiation indicating that the Nutlin-3-mediated inhibition of the p53-MDM2 interaction can positively influence the pro-apoptotic efficacy of dual-treated (PD plus ATO) cells: the averaged Combination Index (CI) values calculated from the ED50 (50% effective dose), ED75 and ED90, in Nutlin-3/PD/ATO versus PD/ATO treated cells were 0.36± 0.03 versus 0.72± 0.02 and 0.28 ± 0.11 versus 0.50 ± 0.15 in OCI-AML-3 and in MOLM-13 respectively. In order to investigate the molecular effectors involved in Nutlin-3 -PD-ATO or PD-ATO-induced apoptosis we first studied the kinetics (2h, 12h, 24h and 48h) of p53, in OCI-AML-3 and MOLM-13. In the absence of Nutlin-3 ATO, even at high doses, did not promote a p53 accumulation whereas modulated the expression of the p73 gene by inducing the pro-apoptotic and anti-proliferative TAp73 and the antiapoptotic and proproliferative ΔNp73 isoforms, thereby failing to elevate the TA/ ΔNp73 ratio. Conversely, treatment with PD reduced the level of ΔNp73 and blunted the ATO-mediated up-regulation of ΔNp73 thus causing an increase in the TA/ΔNp73 ratio of dual-treated cells (PD/ATO). Notably, in AML cells treated with PD/ATO, the addition of Nutlin-3 not only increased p53 protein levels but also induced a strong reduction of the ΔNp73, dominant-negative inhibitor of wild-type p53 and TAp73, leading to an enhanced expression of the p73/p53 target genes P53AIP1 and Puma, and loss of mitochondrial membrane potential. Finally, we found that Nutlin-3 significantly increased the antileukemic activity of PD/ATO in the majority of the primary AML cell samples (n=14) ex vivo analyzed. Altogether these findings suggest that the pro-apoptotic p73 pathway, involved in PD/ATO efficacy, can be potentiated by the rescue of p53 pathway, involved in PD/ATO efficacy, can be potentiated by the Nutlin-3 mediated rescue of p53 pathway in AML cells that possess a functional p53 pathway and provide a rationale for an effective and relatively specific therapeutic strategy for AML.