Modulazione farmacologica del trasporto inverso del colesterolo: studi in vivo ed in vitro dell’effetto inibitorio della Ciclosporina A.

Abstract

Il trasporto inverso di colesterolo macrofagico (RCT) è il processo con il quale il colesterolo è rimosso dalle cellule schiumose delle placche aterosclerotiche nelle pareti arteriose, trasportato tramite le lipoproteine ad alta densità (HDL) nella circolazione, captato dal fegato ed infine eliminato con la bile e le feci.Tale processo è riconosciuto essere protettivo per lo sviluppo dell’aterosclerosi. Numerose dimostrazioni indicano che il rischio cardiovascolare è aumentato in pazienti che hanno subito trapianto di organo e sono in trattamento con il farmaco immunosoppressore Ciclosporina A (CsA). Al fine di indagare eventuali effetti della CsA sull’RCT in vivo, abbiamo trattato 10 topi C57BL/6 per 14 giorni con CsA al dosaggio di 50 mg/kg/die, o con il solo veicolo, mediante iniezione sottocutanea e, al termine del trattamento, abbiamo misurato l’efficienza del processo di RCT macrofagico servendoci di una metodica radio isotopica. I risultati ottenuti mostrano come il processo di RCT risulti alterato dopo il trattamento dei topi con il farmaco. Abbiamo inizialmente indagato se l’inibizione dell’RCT fosse a carico della prima tappa del processo: l’efflusso di colesterolo dai macrofagi. I risultati ottenuti da esperimenti in vitro di valutazione della capacità delle cellule di rilasciare il colesterolo mediante diversi trasportatori di membrana dopo trattamento con CsA, e della capacità del plasma dei topi trattati o meno con CsA di stimolare l’efflusso di colesterolo dalle cellule, non hanno mostrato alcuna attività inibitoria da parte del trattamento con il farmaco. Mediante esperimenti in cellule epatiche (Fu5AH), abbiamo dimostrato che il trattamento dei topi con CsA ha invece alterato la seconda tappa dell’RCT, inibendo la captazione di colesterolo mediato dal Recettore Scavenger BI (SR-BI), dopo esposizione delle stesse a plasma di topi trattati. Inoltre abbiamo dimostrato che il trattamento con CsA porta a riduzione anche della terza tappa dell’RCT, l’escrezione di colesterolo nelle feci. Per approfondire come la CsA esplichi tale azione inibitoria, abbiamo analizzato, in campioni epatici dei topi trattati o meno, l’espressione genica dei trasportatori responsabili dell’escrezione di colesterolo nella bile, i trasportatori ATP-Binding Cassette G5 e G8 (ABCG5/G8), e dell’enzima colesterolo-7-α-idrossilasi (CYP7α), coinvolto nella conversione del colesterolo in acidi biliari. Analisi di RT-PCR hanno evidenziato una assenza di effetti negativi nell’espressione dell’mRNA dei trasportatori e una riduzione significativa dell’espressione del Cyp7α, nei topi trattati con il farmaco. L’analisi dell’espressione proteica dei trasportatori non ha mostrato alcuna differenza tra I topi trattati con CsA e quelli non trattati. Abbiamo ripetuto le analisi in campioni intestinali, in cui ABCG5/G8 sono responsabili dell’escrezione di colesterolo dal plasma al lume intestinale, e abbiamo misurato anche l’espressione genica del trasportatore responsabile del riassorbimento di colesterolo intestinale, la proteina Niemann Pick C1-Like 1 (NPC1L1). I risultati ottenuti dall’analisi sia di Abcg5/g8 che di Npc1l1, non hanno mostrato differenze significative tra i topi del gruppo controllo e trattato con CsA. Abbiamo inoltre effettuato esperimenti in vitro per indagare se la CsA, non alterando l’espressione genica di ABCG5/G8, causa inibizione dell’attività di ABCG5/G8 nell’intestino. Mentre esperimenti in vitro di efflusso di colesterolo nella parte apicale di cellule CACO2 hanno mostrato una inibizione del trasporto di colesterolo attraverso ABCG5/G8 dopo trattamento delle cellule con CsA, la quantificazione del β–sitosterolo nel plasma dei topi trattati con CsA ha mostrato quantitativi simili tra gli animali dei due gruppi. In conclusione, questi risultati indicano che il trattamento CsA altera in vivo il processo di RCT macrofagico, in particolare mediante l’inibizione della seconda e terza tappa del processo, la captazione epatica del colesterolo e la sua escrezione fecale, senza agire sulla prima tappa, l’efflusso di colesterolo dai macrofagi. I nostri risultati indicano che l’effetto negativo si esplica principalmente attraverso l’inibizione del trasporto di colesterolo mediante SR-BI epatico e della sintesi degli acidi biliari mediante il CYP7α.

Macrophage Reverse Cholesterol Transport (RCT) process, by which cholesterol is removed from the foam cells in the arterial wall and transported by lipoproteins (HDL) to the liver for elimination into the feces, is recognized as protective against atherosclerosis. Abundant data indicate that cardiovascular risk is increased in transplanted patients treated with the immunosuppressant drug Cyclosporine A (CsA). To investigate whether CsA impairs in vivo RCT, we treated C57BL/6 mice (n=10) with CsA for 14 days at 50 mg/kg/die, or with the only vehicle, through subcutaneous injection and, at the end of treatment, we measured macrophage RCT by using a radio isotopic technique. What we saw is that RCT is impaired after mice CsA treatment. We initially investigate whether CsA treatment inhibited the first step of the process: cholesterol efflux from macrophages. We evaluated the cells capacity to release cholesterol through various cholesterol transporters after CsA treatment, and the capacity of CsA treated or not mice plasma to stimulate cholesterol efflux from cells; CsA treatment did not impair none of these processes. Through experiments carried out in hepatic cells, we demonstrate that CsA impairs the second step of the RCT process, through the inhibition of cholesterol uptake by the Scavenger Receptor BI (SR-BI), after cells exposition to plasma from CsA treated mice. Moreover we demonstrate that, after CsA treatment, also the third step of RCT in mice, fecal cholesterol excretion is impaired. To investigate how CsA carries out this effect we analyzed, in hepatic tissues of CsA treated or untreated mice, gene expression of transporters responsible for sterol excretion into the bile, ATP-Binding Cassette transporters G5 (ABCG5) and G8 (ABCG8), and cholesterol-7-α-hydroxylase (CYP7α), involved in cholesterol conversion into bile acids. RT-PCR analysis revealed a lack of negative effect on transporters mRNA expression and a significant reduction in Cyp7α mRNA expression in CsA treated mice. In contrast, ABCG5/G8 western blotting analysis showed similar protein content in the two sample groups. We repeated the analysis in mouse intestinal tissues, where ABCG5/G8 are responsible for the excretion of cholesterol in the intestinal lumen, together with RT-PCR of Niemann-PickC1-Like 1 (NPC1L1) protein, involved in cholesterol intestinal absorption. Both RT-PCR analysis on Abcg5/g8 and Npc1l1, showed no significant differences between the control group and CsA treated group. We also made in vitro experiments to investigate if CsA impairs the activity of ABCG5/G8 transporters in the intestine. While experiments of in vitro cholesterol efflux from the apical side of CACO2 cells showed an inhibition of cholesterol transport through ABCG5/G8 after CsA treatment, the measurement of β–sitosterol in CsA treated mice plasma showed a similar content to plasma from untreated mice. Taken together, these results indicate that CsA treatment impaired the in vivo process of macrophage RCT, in particular by affecting its second and third step, cholesterol hepatic uptake and fecal sterol excretion, without affecting the first step, cholesterol efflux from macrophages: our results indicate that this negative effect of CsA occurs possibly through the inhibition of cholesterol transport through hepatic SR-BI and of biliary acids synthesis through CYP7α.