New generation recombinant antigenic peptides for vaccine and diagnostic antibody production

Abstract

L’attività di ricerca si è incentrata su due progetti distinti. Il primo ha riguardato lo sviluppo di un vaccino ricombinante contro la malattia di Alzheimer. Partendo da un precedente studio focalizzato sul peptide amiloide Abeta42 e sull’identificazione di uno o più epitopi in grado di indurre la produzione di anticorpi contro il suddetto peptide, il mio lavoro ha riguardato l’immunizzazione di 60 topi BALBc con due diversi epitopi (Abeta1-7 ripetuto 9 volte e Abeta1-15 ripetuto 4 volte) inseriti nella proteina scaffold tioredossina (TRX) di E.coli mediante tecnologia TDMI (Thioredoxin-Displayed Multipeptide Immunogens) precedentemente sviluppata, e applicata al sistema Alzheimer, dal nostro gruppo di ricerca. In questo nuovo studio si è voluto valutare l’efficacia come “enhancer” immunitario di diversi adiuvanti approvati per uso umano (montanide e allume), della flagellina di Salmonella enterica (Fli) prodotta in forma ricombinante e fusa alla TRX (Fli-TRX) e di costrutti sovramolecolari ottenuti dall’aggregazione dell’antigene con pareti di Lattococcus lactis (BLP-TRX). In una prima fase esplorativa topi wild-type (Balb/C) sono stati vaccinati (priming) e sottoposti a 3 ulteriori richiami (boost) a intervalli di 15 giorni l’uno dall’altro, utilizzando come epitopo sia il frammento Abeta(1-15) (una sorta di controllo positivo) sia il frammento Abeta(1-7) del peptide Ab42. Dopo il sacrificio degli animali, ne è stato prelevato il sangue ed estratto il siero, che è stato utilizzato per l’analisi del titolo anticorpale anti-Abeta mediante ELISA e alla successiva isotipizzazione degli anticorpi anti-Abeta prodotti. E’ emerso che le formulazioni BLP-Trx-Fli-Abeta(1-7)9 senza adiuvante e BLP-Trx - Abeta(1-7)9 + l’immunoadiuvante montanide sono risultate le più idonee nello stimolare una significativa risposta immunitaria (titoli anticorpali ≥12800) contro il peptide amiloide. I risultati di altri studi hanno parallelamente evidenziato come la TRX di Pyrococcus furiosus sia superiore come scaffold molecolare per uso vaccinale rispetto alla TRX di E.coli sia per quanto riguarda il constraining conformazionale, sia per l’elevata divergenza dalle TRX eucariotiche, da cui deriva una minore probabilità di generare anticorpi cross-reattivi contro queste ultime. Nella seconda fase dello studio, si è quindi costruito un prototipo di un vaccino basato sulle due nuove formulazioni emerse dallo studio condotto sui topi Balb/C utilizzando la TRX di P. furiosus come scaffold macromolecolare: BLP-Trx P.furiosus-Fli - Aβ(1-7)9 e Trx P.furiosus - Aβ(1-7)9 + montanide. Con queste due formulazioni ed i rispettivi placebo (costrutti contenenti le TRX prive dell’epitopo) si è intrapreso uno studio della durata di 14 mesi condotto su 60 topi transgenici Tg2576 (sovraesprimenti la variante svedese, APPSwe della proteina APP umana) che a partire dal 9 mese di vita sviluppano una sintomatologia Alzheimer-like, e 24 BALB/c come controlli “normali”. L’obiettivo primario di questo studio a lungo-termine era valutare l’efficacia del vaccino nel prevenire il deficit cognitivo associato al progredire della patologia Alzheimer-like, oltre allo sviluppo dei sintomi istopatologici della malattia quali le placche amiloidi e l’accumulo/sovraproduzione di strutture oligomeriche Abeta. Al quinto mese di trattamento è stato effettuato un prelievo intermedio di sangue caudale da 12 dei 60 topi Tg2576. L’analisi del titolo anticorpale anti Aβ42 mediante ELISA ha rivelato livelli anticorpali molto al di sotto dell’atteso e si è quindi deciso di aumentare di circa 10 volte la dose della formulazione Trx P.furiosus - Aβ(1-7)9 + montanide e di 3 volte la dose della formulazione BLP-Trx P.furiosus-Fli - Aβ(1-7)9. Al termine del trattamento sono stati effettuati due diversi test comportamentali (Y-Maze e Contextual Fear Conditioning), che non hanno rivelato differenze significative tra i topi trattati e non trattati. Si è voluto quindi verificare se, nonostante il risultato comportamentale negativo, i topi trattati avessero un diverso titolo anticorpale rispetto ai non trattati. Anche in questo caso non si sono osservate differenze significative tra placebo e trattati, tranne che in pochi singoli animali. Le possibili spiegazioni sono molteplici: l’antigene scelto potrebbe essere di lunghezza troppo ridotta per stimolare una risposta immunitaria; lo stesso antigene potrebbe essere stato somministrato ad un dosaggio insufficiente; l’insorgere di una tolleranza legata alla natura dei topi Tg2576 nei confronti del peptide amiloide; il possibile intervento di fattori di cronicizzazione della patologia in qualche modo legati alla durata estremamente prolungata dello studio (uno dei più lunghi finora mai condotti su questo modello murino). Sono comunque previsti studi su sezioni cerebrali di animali “trattati” e “placebo” per verificare se, almeno a livello istopatologico, la vaccinazione ha determinato un effetto rilevabile, ovvero una significativa riduzione delle placche amiloidi nei topi Tg2576 non trattati (“placebo”) rispetto agli animali trattati con il vaccino. Si valuterà anche l’opportunità di analizzare, negli stessi due gruppi di animali (placebo e trattati), i livelli intracerebrali di oligomeri Aβ42, le specie attualmente ritenute come i primi responsabili della neurotossicità amiloide. A tale scopo ho preventivamente ottimizzato e validato una metodologia di ultima generazione per il dosaggio degli oligomeri Abeta, basata su un test ELISA ed un particolare anticorpo monoclonale (IgM a bassa affinità/alta avidità; OMAB, Agrisera) in grado di catturare selettivamente le forme oligomeriche del peptidie Abeta. La superiore selettività/affidabilità di questo dosaggio lo rende adatto all’analisi non solo di estratti cerebrali, ma anche di altri campioni biologici di potenziale interesse per la diagnostica Alzheimer umana quali il liquido cerebro-spinale (liquor, CSF) e il sangue periferico. Parallelamente allo studio sopra descritto, ho partecipato alla caratterizzazione di un diverso prototipo di vaccino anti-Abeta progettato e prodotto dal gruppo di ricerca coordinato dalla Dott.ssa Antonella Prisco (Istituto di Genetica e Biofisica ABT, CNR, Napoli). In questo caso il vaccino è costituito dai primi 11 amminoacidi del peptide Aβ42 fusi all’N terminale della subunità E2 della piruvato deidrogenasi di Bacillus stearothermophilus (un batterio gram-positivo). I costrutti E2 hanno la capacità di auto-assemblarsi in particelle “virus-like” (VLP) composte da crica 60 elementi (monomeri). L’immunizzazione di topi BALB/c con queste VLP-Abeta genera titoli anticorpali molto elevati e di lunga durata. Mi sto ora occupando della valutazione della capacità di riconoscimento di diverse forme di Ab (monomero, oligomero o fibrilla) da parte degli anticorpi prodotti in risposta ad immunizzazione con diverse formulazioni dell’antigene VLP-Abeta. I risultati di questi esperimenti saranno disponibili prima della stesura della tesi di dottorato e faranno parte di un manoscritto che verrà inviato per la pubblicazione ad una rivista internazionale del settore.

Il secondo progetto ha riguardato la produzione di anticorpi per uso diagnostico contro antigeni proteici “difficili”; ovvero un antigene che non può essere facilmente isolato dalla sorgente naturale o preparato mediante tecnologia del DNA ricombinante e/o non dà luogo ad anticorpi di “buona qualità” (i.e., titolo e specificità elevate). Dato l’antigene, si procede con l’analisi in silico dello stesso tramite diversi programmi per la predizione di epitopi (lineari e conformazionali) in grado di stimolare la produzione di anticorpali (B-Cell epitopes). Recentemente è stata sviluppata e resa disponibile una nuova piattaforma di predizione denominata BEST (B-cell Epitope prediction using Support vector machine Tool) che rappresenta un notevole miglioramento rispetto ai tradizionali programmi per la predizione di B-Cell epitopes. Mi sono quindi occupato della messa punto di tale piattaforma e della sua validazione in silico attraverso il confronto sistematico con epitopi da noi già prodotti e saggiati. In un lavoro precedente, l’inserimento di vari epitopi, selezionati in silico, nello scaffold TRX di E.coli mediante tecnologia TDMI, ha permesso la produzione di anticorpi che, sebbene fossero di buona qualità (e.g., in grado di riconoscere l’antigene in forma nativa), mostravano cross-reattività verso altre proteine. Si sono quindi esplorate strategie alternative alla produzione di anticorpi monoclonali per ridurre tale aspecificità. Una di queste è consistita nell’utilizzo di uno scaffold TRX derivante all’animale impiegato per l’immunizzazione (nel nostro caso il coniglio) anziché la TRX di E.coli. Tra i vari anticorpi che ho prodotto con questa tecnologia, presenta particolare interesse un anticorpo diretto contro le immunoglobuline G a catena pesante (camelid heavy chain IgGs) di camelidi. Infatti, oltre agli anticorpi convenzionali, i camelidi (e.g., lama e alpaca) producono una inusuale forma di anticorpi privi delle catene leggere chiamati heavy chain antibodies. Questi anticorpi a catena pesante, possiedono un dominio variabile (VHH) perfettamente in grado di legare un antigene anche senza il dominio variabile della catena leggera (VL). Tali anticorpi sono particolarmente stabili, facili da produrre e, grazie alle loro ridotte dimensioni, in grado di raggiungere zone dell’antigene che risultano inaccessibili ai normali anticorpi. Presentano per tanto un notevole interesse sia dal punto di vista diagnostico che terapeutico e un’azienda biotecnologica belga ha recentemente brevettato la produzione di piccoli frammenti anticorpali bioattivi (denominati “nanobodies”) derivati dagli anticorpi VHH mediante tecnologia del DNA ricombinante. Dopo aver individuato un epitopo conservato in tutti gli anticorpi di camelide, ma normalmente nascosto dalle catene leggere, tramite tecnologia TDMI ho inserito tale epitopo all’interno della TRX di coniglio e l’antigene risultante è stato utilizzato per prove di immunizzazione di conigli, in collaborazione i laboratori di ricerca della Preclincs (Potsdam, Germania). I risultati ottenuti dimostrano che gli anticorpi generati dall’immunizzazione con il suddetto antigene riconoscono specificamente e con buona efficienza sia VHH che Nanobodies ma non la forma nativa delle normali IgGs (a doppia catena) di camelide. Recenti analisi condotte su vari sieri, derivanti sia da esperimenti ELISA da me effettuati, sia da altri esperimenti, hanno messo in luce un’aspecificità residua (reattività del siero contro la sola TRX). Si è quindi ideata un’altra strategia per la rimozione degli anticorpi aspecifici (principalmente anticorpi diretti contro lo scaffold TRX) mediante l’uso di costrutti basati su BLP. In breve, i sieri prodotti da animali immunizzati con antigeni a base di TRX vengono incubati con BLP pre-saturate con la sola proteina scaffold (TRX priva dell’epitopo d’interesse), in modo da promuovere il legame alle BLP-TRX degli anticorpi diretti contro la TRX, anziché contro l’epitopo d’interesse, ed eliminarli attraverso adsorbimento alle BLP e successiva rimozione delle stesse mediante sedimentazione/centrifugazione. La performance di questa nuova procedura di arricchimento, che si è rivelata decisamente efficace, è stata valutata mediante test ELISA utilizzando (e confrontando) come “capture antigens” la sola TRX e la TRX contenente l’epitopo d’interesse.