Antitumorigenicità del D-Ribosio e KHCO3 sulla linea di carcinoma mammario umano Hs 578T ed effetti sulla linea d'epitelio mammario umano non tumorale Hs 578BST

Abstract

Lo scopo del presente lavoro è quello di studiare come la proliferazione cellulare ed il potenziale migratorio-invasivo, considerati due “hallmarks” della linea cellulare tumorale Hs578T, possano venir modificati dal K:D-Rib, soluzione acquosa di KHCO3 e D-ribosio. Il K:D-Rib può essere concepito come un integratore alimentare e data la sua natura è stato da subito chiaro che lo scopo di questo studio dovesse essere una valutazione comparata degli effetti su un modello tumorale ed un non tumorale. Il composto è stato quindi testato anche su un modello cellulare non tumorale Hs578Bst con lo stesso approccio: si è investigato l’effetto del K:D-Rib sulla proliferazione cellulare. Il ruolo del D-ribosio e dello ione potassio (K+) sono ormai ampiamente noti. Il D-ribosio è un aldopentoso, assiste il metabolismo energetico della cellula oltre ad esser un precursore d’alcuni aminoacidi. Lo ione K+ è coinvolto in molti processi tra cui apoptosi, genesi e mantenimento del potenziale di membrana, stabilizza e coordina il folding dei G-quadruplex. Per saggiare l’effetto del K:D-Rib sulla proliferazione delle linee cellulari non ci siamo potuti avvalere dei comuni saggi metabolici (MTT assay, WST-1 assay ecc) in quanto abbiamo dimostrato che il K:D-Rib interagisce con il bromuro di tetrazolio riducendolo a formazan, così facendo si è dimostrato anche il suo potere antiossidante. Per saggiare gli effetti del trattamento con K:D-Rib, si sono utilizzati due modelli cellulari distinti: Hs 578T (carcinoma mammario umano) ed Hs 578Bst (epitelio, mammario umano, non¬ tumorale). La linea Hs 578T è stata mantenuta in coltura e trattata con K:D-rib 5 mM per 50 giorni. Il n° di split è stato utilizzato per valutare gli effetti de K:D-rib. Il controllo è stato splittato 16 volte mentre il trattato è stato splittato 10 volte. Si è poi calcolato il DP (doubling population time), su un trattamento di 14 giorni ed il controllo ha mostrato un tempo di duplicazione di 44 ore mentre il trattato di 59 ore, tempi significativamente diversi. Questo risultato ci ha spinto a studiare l’effetto del K:D-Rib sul potenziale tumorigenico della linea Hs 578T mediante il saggio d’invasione chemotattica. Le cellule sono state pre-trattate per diversi tempi antecedenti il saggio e per altre 48h durante il saggio stesso. Questo esperimento ci ha permesso di affermare che il K:D-Rib, alla concentrazione di 5 mM, interferisce con il potenziale chemioinvasivo della linea cellulare HTB-126 riducendolo circa dell’80% dopo una settimana di trattamento. Nel contempo si è si è messo a punto un metodo per misurare la concentrazione di potassio K+ utilizzando il DNAzima come biosensonsore. Risultati preliminari indicano che il surnatante delle Hs 578T trattate con K:D-Rib 5mM per 48h mostra una concentrazione di DNAzima inferiore rispetto al DMEM (solo terreno di coltura delle cellule) incubato con K:D-Rib 5mM, ma superiore al solo DMEM (solo terreno) ed al surnatante del controllo (Hs 578T non trattate), dimostrando che vi è un uptake cellulare dello ione K+ e che il DNAzima può essere utilizzato come biosensore per lo ione K+. A completamento di questi esperimenti mediante Microscopia a Forza Atomica si è investigata la morfologia della linea cellulare Hs 578T ed in che modo questa potesse modificarsi in relazione al trattamento con K:D-Rib. Da un’attenta analisi si evince che nelle zone prossimali al nucleo delle cellule trattate, sono presenti riarrangiamenti della membrana cellulare ascrivibili a strutture simili a porosomi. Si può ipotizzare che i porosomi e le invaginazioni membranarie ed essi correlate siano il legame di tipo morfologico fra l’upatke di potassio e la modificazione di hallmarks tumorali quali la proliferazione e la chemoinvasione. Si è quindi si è studiato l’effetto del K:D-Rib anche sulla proliferazione della linea di epitelio mammario non tumorale, Hs 578Bst , utilizzando il “n° di split”. Il dato mostra un rallentamento non significativo del trattato e nessun cambiamento morfologico apprezzabile a seguito del trattamento. Non si sono riscontrati effetti neppure con il solo D-ribosio o il solo KHCO3. Infine vendo dimostrato il ruolo antiossidante del K:D-Rib si è deciso di studiare l’effetto protettivo del K:D-Rib contro i danni da radiazioni simulando in laboratorio due sedute di radioterapia. La dose somministrata è stata pari a 4 Gy, due somministrazioni da 2 Gy, in accordo con i protocolli terapeutici convenzionali, per il tumore mammario. Le misure AFM evidenziano evidenti danni alle strutture citoscheletriche connesse con la membrana ed alla membrana stessa, a seguito di un’esposizione pari a 4 Gy. Al contrario le cellule pre-trattate con K:D-Rib ed irraggiate presentano strutture simili al controllo con limitati effetti da radiazioni.

The aim of this work is to study how the cell proliferation, chemoinvasive and migration potential could be modified by K:D-rib treatment, a water solution of D-ribose and KHCO3. These features are considered neoplastic hallmarks. K:D-rib could be conceived as food integrator and therefore the goal of this research is a comparative valuation of K:D-rib effects on cancer and not cancer study model, respectively Hs 578T and Hs 578Bst. The role of D-ribose and potassium ion (K+) are well known. D-ribose is an aldopentose sugar, assists the energy metabolism of the cell and is a precursor of several amino acids. The K + ion is involved in many processes including apoptosis, genesis and maintenance of membrane potential, coordinates and stabilizes the folding of the G-quadruplex . To test the effect of the K:D-rib on the proliferation of the cell lines we could not use the common metabolic assays (MTT assay , WST -1 assay and so on) as K:D-rib interacts with the bromide tetrazolium reducing it to formazan, by the way demonstrating its antioxidant power. To test the effects of treatment with K:D-rib, we used two distinct cellular models : Hs 578T (human breast carcinoma) and Hs 578Bst (epithelium, human breast, non-tumor) . The line Hs 578T was maintained in culture and treated with K:D-rib 5 mM for 50 days. The slit number was used to assess the effects of K:D-rib. The control cells were split 16 times while the treated was split 10 times. After that Hs 578T cell line was treated with K:D-rib 5 mM for 14 days and the DP (doubling population time) was calculated. The control showed DP time of 44 hours and the treated had a DP time of 59 hours. These results proved the growth rate significantly different. This result prompted us to study the effect of K:D-rib on the tumorigenic potential of the line Hs 578T by means the chemotactic invasion assay. The cells were pre-treated with K:D-rib 5 mM for various times, prior to the assay their chemoinvasive potential. During the chemoinvasion assay the K:D-rib treatment went on for 48h; the test duration. This experiment allowed us to affirm that the K:D-rib, at a concentration of 5 mM, interferes with the chemoinvasive potential of cancer cell line Hs-578T by reducing it approximately 80 % in 9 days of treatment. The uptake of potassium was studied using the DNAzyme as biosensor for measurements of potassium concentration on cell supernatant, before and after treatment of Hs 578T cell line. Preliminary results indicate that the supernatant of Hs 578T treated with K:D-rib 5mM for 48h shows a lower DNAzyme concentration compared to DMEM (only culture medium of the cells) with K:D-rib 5 mM, but higher than the only DMEM (only the ground) and the supernatant of the control (untreated Hs 578T). From these measurements it is possible to demonstrate that there is a cellular uptake of the ion K+ and that the DNAzima can be used as a biosensor for the ion K+ In addition using Atomic Force Microscopy the cell line Hs 578T morphology was investigated to understand if it could change by K:D-rib treatment at the concentration of 5 mM. In the case of Hs 578T treated cells a careful analysis shows the presence of cell membrane rearrangement perhaps related to “porosomes structure like”. The majority of these structures are in the perinuclear area of the cells. Not so evident structures are found on not treated cancer cell membrane. It could be speculate of “porosomes structure like” and the membrane invaginations correlated, are the morphology link between hallmark cancer modification and the potassium uptake. By means of the not tumour cells model we studied the effects of K:D-rib 5 mM on the Hs 578Bst cell line (human mammary epithelial cell line) by mean the spit number to valuate the growth rate. After 25 days of treatment the treated cells do not display a relevant decrease of growth rate respect the untreated cells. Having demonstrated the antioxidant role of the K:D-rib, it was decided to study the protective effect of K:D-rib against radiation damage in laboratory by mimicking two sessions of radiotherapy pre-treating the cells with K:D-rib 5 mM. The total dose administered was 4 Gy, fractionated in two dose of 2 Gy each one, in agreement with the conventional treatment protocols for breast cancer radiotherapy. The AFM measurements showed significant damage to cytoskeletal structures associated with the membrane and the membrane itself, following an exposure of 4 Gy. In contrast, cells pre-treated with K:D-rib at the concentration of 5 mM have similar structures to the control avoiding more ionizing radiation effects.