Exploring tissue regeneration potential of multipotent mesenchymal cells from human placenta. Mimicking hyperglycaemia in vitro affects cell proliferation and differentiation properties

Abstract

The recent interest that has aroused about the discovery and functional characterization of stem cells is based on the firm belief that they can offer new therapeutic possibilities for the cure of degenerative and genetic pathologies. Regenerative medicine, tissue engineering and gene therapy display an urgent need to isolate cells that can lead to regeneration of a healthy tissue, in order to counterbalance disease-induced cellular death and tissue damage. Stem cells show two peculiar features that make them particularly suitable for regenerative medicine applications: high proliferative capacity and differentiation potential. These terms are generally comprised in the concept of plasticity. Adult stem cells have been isolated from several different tissues (nervous system, peripheral blood, bone marrow, epidermis). Unfortunately, the origin from an adult organism reduces plasticity of stem cells, limiting their possible exploitation by therapeutic field. In this case, embryonic stem cells display optimal potential; anyway, their isolation raises ethic and moral controversies that prevent their use in many countries all over the world, included Italy. During the research of alternative sources of stem cells, we focused on human placenta, given that it is an easily available organ in which the presence of cells with stemness features has been well-documented. This doctoral thesis demonstrated that term human placenta is an organ endowed with stem elements of different origin and nature. We established an experimental protocol to allow an easy and effective isolation of such elements from foetal region of placenta, with particular regard to cell originated from mesenchymal lineage. Both placentas from healthy donors and diabetic patients were collected and their cells isolated. These cells were expanded in culture as a plastic adherent homogeneous population of CD34neg fibroblast-like cells displaying high proliferative potential and clonal properties. Both cells from healthy and diabetic donor expressed a unique pattern of mesenchymal and multipotency antigens which excluded contamination from other undifferentiated or mature cell types (hematopoietic stem and endothelial cells) and contributed to define them as human Chorionic Mesenchymal Stem Cells (hCMSC). Multipotency properties and differentiation potential were demonstrated through in vitro induction of adipogenic, osteogenic and chondrogenic commitment. Given the intrinsic plasticity showed, mesenchymal multipotent placenta-derived cells could be employed for regeneration of hard tissues. Mesenchymal multipotent cells from human placenta also displayed reduced immunogenicity and immunomodulatory properties if compared to well-characterized mesenchymal stem cells from bone marrow. This study also evaluated the effects of sustained hyperglycaemia in vitro on proliferation and differentiation properties of mesenchymal multipotent cells from human placenta. In particular, we focused on commitment towards endothelial lineage. We provided proofs for the impairment of cells proliferation potential caused by prolonged exposure to hyperglycaemia and demonstrated that these events created a microenvironment able to increase cell responsiveness to treatment with endothelial-specific growth factors. In fact, placental cells incubated with high glucose (25mM), VEGF and FGF2 committed towards endothelial lineage until they reached an intermediate differentiation status. Thus, we concluded that hyperglycaemia in vitro might not be a barrier for the effective functional improvement of placental cells transplantation, but, on the contrary, it could function by supporting cells metabolic needs during differentiation and enhancing growth factor action.

Il recente interesse sviluppatosi attorno alla scoperta e alla caratterizzazione funzionale delle cellule staminali si basa sulla convinzione scientifica che esse possano offrire nuove possibilità terapeutiche per la cura di malattie degenerative ed ereditarie. Discipline come la medicina rigenerativa, l’ingegneria tissutale e la terapia genica muovono infatti dalla necessità di isolare cellule che possano garantire la neo-formazione di un tessuto sano laddove la malattia ha causato morte e degenerazione cellulare. Due sono le peculiarità delle cellule staminali che le rendono particolarmente adatte a questi scopi: l’alta capacità proliferativa e il potenziale differenziativo, termini che possono essere compresi nel concetto di plasticità. Cellule staminali adulte sono state isolate da molti tessuti differenti (sistema nervoso, sangue periferico, midollo osseo, pelle). La provenienza da un organismo adulto diminuisce però la plasticità di tali cellule, limitandone le possibili applicazioni in campo terapeutico. In questo ambito le cellule di origine embrionale mostrano le massime potenzialità; tuttavia il loro isolamento implica risvolti etico-morali che ne hanno impedito l’uso in molti paesi del mondo, Italia compresa. Nella ricerca di fonti alternative di cellule staminali la nostra scelta è pertanto caduta sulla placenta, in quanto organo facilmente reperibile nel quale la presenza di staminali è stata ampiamente documentata. Questa tesi di Dottorato ha dimostrato che la placenta umana è un organo nel quale si ritrovano elementi staminali di differente origine e natura. Abbiamo stabilito un protocollo sperimentale che permettesse il facile ed efficace isolamento di tali elementi, in particolare quelli appartenenti alla linea mesenchimale, dalla porzione fetale della placenta. Sono state raccolte sia placente da donatore sano che da paziente diabetico e le loro cellule sono state isolate. Queste cellule sono state amplificate in coltura come una popolazione omogenea di cellule CD34neg di forma fibroblastoide. Esse mostravano inoltre un alto potenziale proliferativo e proprietà clonali. Entrambi i tipi cellulari, isolati da paziente sano o da donatore diabetico, esprimevano un pannello unico di antigeni mesenchimali e di multipotenza, grazie ai quali è stato possibile escludere la contaminazione da parte di altre cellule, sia indifferenziate che mature (staminali ematopoietiche ed endoteliali). L’espressione degli stessi antigeni ha permesso di definire le cellule isolate come Cellule Staminali Corioniche Mesenchimali (hCMSC). Le proprietà di multipotenza e il potenziale differenziativo di queste cellule sono stati valutati inducendone in vitro il differenziamento nelle linee adipogenica, osteogenica e condrogenica. Date le spiccate caratteristiche di plasticità dimostrate, le cellule mesenchimali multipotenti isolate da placenta possono trovare impiego nella rigenerazione dei tessuti duri. Se paragonate a cellule staminali mesenchimali isolate da midollo osseo, esse sono inoltre caratterizzate da ridotta immunogenicità e proprietà immuno-modulatorie. Questo studio ha inoltre inteso valutare gli effetti di una prolungata esposizione all’iperglicemia in vitro sulla proliferazione e le capacità differenziative delle cellule estratte da placenta umana. In particolare è stato valutato il potenziale di commitment in senso endoteliale. Abbiamo fornito prove della riduzione delle capacità proliferative di queste cellule in seguito a lunga incubazione iperglicemica e abbiamo dimostrato che questi eventi contribuiscono a creare un microambiente in grado di aumentare la responsività delle stesse cellule al trattamento con specifici fattori di crescita che inducono il differenziamento endoteliale. Infatti, cellule placentari incubate con alto glucosio (25mM), VEGF e FGF2 si differenziavano in cellule della linea endoteliale fino al raggiungimento di uno stato intermedio di maturazione. Abbiamo quindi concluso che l’iperglicemia in vitro non rappresenta una barriera per il miglioramento dei protocolli di impiego di cellule placentari nelle pratiche degli trapianti. Al contrario, essa può fungere da supporto ai bisogni metabolici delle cellule durante i processi di differenziamento, anche mediante aumento dell’efficacia d’azione dei fattori di crescita.