Morphological, ultrastructural and immunohistochemical identification of cardiac lymphatic vessels and their functional role in cardiomyopathies

Abstract

Il sistema linfatico consiste in una fitta rete di capillari e vasi che vanno a formare un circolo aperto e monodirezionale parallelo a quello sanguigno. Tra le sue più importanti funzioni figurano l’assorbimento degli acidi grassi ed il mantenimento dell’omeostasi tissutale mediante drenaggio di liquidi e proteine plasmatiche fuoriuscite dai capillari sanguigni nei tessuti. Il circolo linfatico, attraverso le stazioni linfonodali, svolge anche un ruolo determinante nel trasporto delle cellule immunitarie, garantendo la sorveglianza immunologica e permettendo alle cellule immunitarie di raggiungere velocemente il sito di danno. Lo studio della circolazione linfatica è sempre più importante in oncologia, visto il suo coinvolgimento nei meccanismi di migrazione delle cellule neoplastiche che portano allo sviluppo di metastasi. Lo studio dei vasi linfatici è stato per lungo tempo ostacolato dalla difficoltà nella loro identificazione e distinzione dai vasi sanguigni. La recente scoperta di marcatori come Podoplanina (PDPN), “lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1” (Lyve-1) e “Prospero- related homeobox 1”(Prox-1), che sono espressi specificamente in cellule endoteliali linfatiche, ha notevolmente favorito il loro studio istologico in tutti i distretti dell’organismo, compreso il cuore. Infatti, anche se la prima descrizione dei vasi linfatici nel cuore risale a circa tre secoli fa, solo di recente è stato rivalutato il loro ruolo sia nel mantenimento dell’omeostasi del tessuto interstiziale che in condizioni patologiche. Restano ancora da chiarire i meccanismi che regolano la linfangiogenesi a livello cardiaco ed i fattori di crescita coinvolti. Il più rilevante sistema di regolazione della linfangiogenesi si sviluppa sull’asse VEGF-C/VEGFR-3, ma anche altri fattori di crescita si sono dimostrati capaci di stimolare la crescita di vasi linfatici. Ad esempio il “Plateled derived growth factor” (PDGF) è un fattore di crescita da tempo conosciuto per la sua azione pro-angiogenica e il suo coinvolgimento nei meccanismi di reclutamento di cellule vascolari murali come i periciti. Recentemente è stata provata la sua importanza anche nell’induzione della linfangiogenesi tumorale. La prima fase di questo lavoro consiste nella caratterizzazione immunofenotipica, strutturale ed ultrastrutturale dei vasi linfatici in diversi organi umani e murini. Sezioni istologiche, ottenute sia da campioni autoptici umani che da organi isolati da modelli sperimentali, sono state analizzate tramite tecnica immunoistochimica in fluorescenza per verificare l’espressione dei più importanti markers linfatici. I markers risultati più specifici e maggiormente espressi sono quindi stati selezionati per valutare fenotipo, densità e distribuzione del sistema linfatico. La distribuzione dei vasi linfatici nel cuore umano e murino risulta simile. Questi si concentrano principalmente nelle regioni subepicardiche e negli spazi interstiziali che circondano arterie e vene. Un piccolo numero di capillari linfatici si ritrova nelle parti più profonde del muscolo cardiaco tra i cardiomiociti. La successiva analisi mediante microscopia elettronica ci ha permesso di analizzare le caratteristiche ultrastrutturali associate ai vasi linfatici, non facilmente rilevabili con altre metodiche. I vasi linfatici mostrano una parete molto sottile rispetto ai vasi sanguigni, una membrana basale assente o discontinua e frequenti interruzioni del monostrato endoteliale, conosciute come fenestrature. Un'ulteriore conferma della natura linfatica dei vasi analizzati è stata ottenuta tramite tecnica Immunogold con anticorpi specifici per il Lyve-1. Le tecniche precedentemente descritte ci hanno permesso di ottenere informazioni esclusivamente bidimensionali, mentre l’architettura vascolare all’interno dell’organo è tridimensionale. Per superare questo limite tecnico è stato quindi messa a punto una nuova tecnica, denominata micro-linfangiografia in fluorescenza. In seguito all’iniezione di due traccianti fluorescenti, l’intero spessore del ventricolo di ratto viene analizzato al microscopio confocale. La tecnica permette di ottenere ricostruzioni tridimensionali della rete di vasi linfatici all’interno dell’organo. Nella fase successiva del lavoro sono stati valutati gli aspetti funzionali del sistema linfatico cardiaco. Il tessuto cardiaco è stato analizzato sia nelle condizioni normali, sia nelle condizioni conseguenti allo sviluppo di diverse cardiomiopatie. Ognuna delle cardiomiopatie analizzate è scatenata da un diverso agente eziologico. Nella cardiomiopatia ipertrofica ostruttiva (HOCM) è la mutazione di geni codificanti per proteine sarcomeriche a determinare lo sviluppo di ipertrofia settale accompagnata da disfunzione diastolica. Il danno ischemico è invece la causa scatenante della più comune cardiomiopatia di origine estrinseca, ovvero l’infarto del miocardio (MI). La cardiotossicità risulta infine tra i principali effetti avversi conseguenti al trattamento con diversi farmaci antitumorali come Doxorubicina e Imatinib . Il primo farmaco fa parte della famiglia delle antracicline, e come tale determina un effetto cardiotossico ampiamenente studiato e conosciuto. L’Imatinib è invece un inibitore dei recettori tirosina-chinasici (TKI) e rappresenta uno dei più grandi successi della medicina per quel che riguarda la cura delle neoplasie, approvato per il trattamento della leucemia mieloide cronica e dei tumori gastrointestinali. Tra i principali target dell’IM figurano recettori di grande importanza per la regolazione dell’angiogenesi nonché della linfangiogenesi, come il c-kit, il PDGFR e il VEGFR-3. Lo studio di campioni derivanti da miectomie chirurgiche di pazienti affetti da HCM ha messo in evidenza una forte risposta linfangiogenica all’interno dell’organo. I risultati dell’analisi immunoistochimica indicano una sensibile riduzione del numero di capillari sanguigni, in termini di densità (numero di vasi per unità di area analizzata). Questa alterazione del letto vascolare sanguigno risulta semplice da giustificare se si tiene conto di quelle che sono le principali caratteristiche istomorfologiche della malattia, ovvero la fibrosi interstiziale, l’aumento della dimensione dei miociti ed il loro disarray. Il comportamento del sistema linfatico ha però un andamento completamente diverso. Si osserva un aumento marcato della densità dei vasi linfatici sia a livello dello spesso strato di tessuto fibrotico presente nel versante subendocardico, sia a livello dei tessuti muscolari cardiaci più profondi. L’aumento in termini di densità è accompagnato da un altrettanto marcato incremento dell’indice proliferativo che è stato misurato andando a quantificare i livelli di espressione nucleare di proteine specifiche del ciclo cellulare e della mitosi. Nella risposta dell’organo ad un insulto ischemico come l’infarto, è stato osservato un significativo aumento del numero dei vasi linfatici. Questo aumento risulta differito rispetto alla risposta angiogenica e funzionalmente associato alle diverse fasi di maturazione della cicatrice fibrotica. Anche nella cardiotossicità indotta da DOXO si registra un aumento di densità della componente linfatica associata alla marcata deposizione di collagene tipica di questa cardiopatia. Un comportamento completamente diverso si osserva invece nella cardiotossicità indotta da IM. Il cuore degli animali trattati con il farmaco mostra, in associazione ad una forte riduzione dei vasi linfatici, un aumento nel contenuto relativo di acqua. Il trattamento con il farmaco è quindi in grado di alterare la funzione di drenaggio del miocardio contribuendo allo sviluppo della disfunzione dell’organo. A livello ultrastrutturale, abbiamo inoltre potuto documentare in microscopia elettronica un’estesa compromissione dei mitocondri nei vasi sanguigni e linfatici. In conclusione i dati ottenuti dimostrano che, in ognuna delle condizioni patologiche analizzate, il sistema linfatico risulta importante nella risposta del cuore ai diversi insulti subiti ed assume un ruolo determinante per il suo rimodellamento. L’interferenza nei meccanismi linfangiogenici può determinare un’alterazione dell’omeostasi tissutale e quindi contribuire negativamente allo sviluppo di cardiopatie