Studi di genomica comparativa e caratterizzazione biochimica di enzimi coinvolti nel catabolismo delle purine.

Abstract

La degradazione delle purine è una via metabolica presente in tutti gli organismi viventi. Il pathway presenta una variabilità di enzimi e intermedi. Questa caratteristica in parte è causata dall'evoluzione convergente di alcuni enzimi. Infatti, è frequente trovare all'interno del pathway enzimi che non presentano alcuna omologia tra loro, ma risultano implicati nella catalisi della stessa reazione. I composti purinici contengono quattro atomi di azoto. In base alle esigenze metaboliche degli organismi alcuni hanno scelto di eliminare questi composti, come prodotti di scarto, altri di degradarlo completamente per recuperare ammonio. Un'altra causa di variabilità è che alcuni organismi, capaci di recuperare l'azoto dalle basi puriniche, possono ricavare urea dai composti purinici e sono dotati di enzimi coinvolti nella degradazione dell'urea, altri mancano di questi enzimi e pertanto devono recuperare direttamente l'ammonio da questi composti. La variabilità riscontrata in questa via metabolica è presente soprattutto nei microorganismi, pertanto, studi di genomica comparativa e dei cluster batterici permettono di identificare l'attività di enzimi a funzione sconosciuta. Spesso gli enzimi identificati nei batteri per omologia hanno permesso di trovare e caratterizzare enzimi coinvolti in questo pathway di organismi eucariotici. Questo tipo di approccio è stato utilizzato in questo lavoro sia per l'identificazione di nuovi enzimi coinvolti nel pathway sia per poter prevedere l'abilità di alcuni microorganismi di utilizzare composti purinici come fonte di azoto. In particolare il mio lavoro di dottorato può essere schematizzato in 7 differenti punti di cui solo i primi 5 sono stati discussi in questa tesi.

1) Capitolo 2: Studi di genomica comparativa per la ricerca di geni coinvolti nel catabolismo delle purine in microorganismi probiotici e nel microbioma umano. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di investigare la capacità di microorganismi tradizionalmente usati come probiotici e residenti nell'intestino di degradare l'acido urico col fine di trovare dei batteri da includere in preparati probiotici per la prevenzione dell'iperuricemia. La ricerca bioinformatica è stata svolta cercando nei genomi di organismi tradizionalmente usati come probiotici e nel microbioma dell'intestino umano geni noti essere coinvolti nel trasporto o nella degradazione delle purine. L'analisi ha richiesto uno studio più approfondito sulla filogenesi dei trasportatori e l'analisi di un nuovo probabile cluster per la degradazione delle purine presente in Escherichia coli. I dati raccolti dimostrano che B.subtilis e E.coli possono essere dei buoni candidati. Questo progetto è stato finanziato da Spinner su interesse dell'azienda Stardea Parma.

2) Capitolo 3: Caratterizzazione biochimica di un nuovo enzima coinvolto nella degradazione dell'acido allantoico a ureidoglicolato. Sono stati recentemente studiati gli enzimi codificanti per l'ureidoglicina idrolasi (UGlyAH)di E. coli e Arabidopsis thaliana. L'albero filogenetico costruito utilizzando sequenze omologhe a entrambi gli enzimi risulta essere diviso in due famiglie ben distinte: enzimi di classe I e enzimi di classe II. Sono stati analizzati i genomi di organismi aventi i geni appartenenti a entrambe le classi. Le analisi mostrano che gli enzimi di classe I risultano sempre essere associati all'allantoato amidoidrolasi, mentre in quelli di classe II non è presente alcun enzima coinvolto nella sintesi dell'ureidoglicina. I risultati ottenuti dall'analisi dei genomi permette di ipotizzare un' attività diversa tra gli enzimi appartenenti alle due classi. Il gene codificante l'enzima di Agrobacterium tumefaciens appartenente alla classe II, gruppo in cui non esistono enzimi caratterizzati, è stato clonato, purificato e caratterizzato dal punto di vista biochimico. Le proprietà di questo enzima sono state comparate con quelle dell'omologo di A. thaliana appartenente alla classe I.

3) Capitolo 4: Caratterizzazione biochimica dell'enzima allantoina racemasi di Pseudomonas fluorescens. La (S)-allantoina è un composto che si origina durante il catabolismo delle purine. Alcuni organismi possono assorbire allantoina racemica dall'esterno e utilizzarla come fonte di azoto. L'allantoinasi, un enzima capace di convertire l' allantoina ad acido allantoico, è stereospecifico per la (S)-allantoina. La conversione dell'acido allantoico a gliossilato mediante l'utilizzo di differenti enzimi porta al recupero di ammonio che potrà essere poi riutilizzato per la sintesi di nuovi composti azotati. Per metabolizzare in modo efficace l'allantoina molti organismi possiedono l'allantoina racemasi. L'attività di questo enzima è conosciuta da tempo, ma solo recentemente è stata clonata e cristallizzata l' allantoina racemasi di Klebsiella pneumoniae. Indipendentemente, nel nostro laboratorio, è stata identificata, clonata e espressa l'allantoina racemasi di Pseudomonas fluorescens e tramite una collaborazione con il professor Zanotti è stata cristallizzata. Confrontando le due strutture emerge che l''enzima di K. pneumoniae presenta 2 cisteine nel sito attivo mentre quella di K. pneumoniae un glutammato e una cisteina . Sono stati svolti dei saggi di attività per confermare l'attività di allantoina racemasi dell'enzima di P. fluorescens e costruiti dei mutanti per dimostrare l'importanza del glutammato nel sito attivo.

4) Capitolo 5: Studio dei prodotti della perossidasi di rafano durante l'ossidazione dell'acido urico e determinazione della stereospecifità degli enzimi HIU idrolasi e OHCU decarbossilasi. La perossidasi così come l'uricasi è un enzima capace di ossidare l'acido urico. L'uricasi ossida l'acido urico a (S)-5-HIU,al contrario, i composti che si originano dalla reazione catalizzata dalla perossidasi non sono stati ancora identificati, anche se è noto che si degradano spontaneamente a formare allantoina. I due enzimi differiscono tra loro sia per il meccanismo di reazione che per proprietà cinetiche. L'indagine sui prodotti della reazione catalizzata dalla perossidasi è stata condotta sia allo spettrofotometro che allo spettropolarimetro. I prodotti di questa reazione non presentano alcuna attività ottica, nelle analisi condotte con lo spettropolarimetro, indicando così la sintesi di composti racemi. Gli spettri raccolti allo spettrofotometro sono invece comparabili ai prodotti ottenuti dall'ossidazione dell'acido urico da parte dell'uricasi.I prodotti ottenuti da questa reazione sono stati utilizzati per testare la stereospecidicità degli enzimi HiuHy e OHCUdec, coinvolti nella conversione del (S)-5-HIU a (S)-allantoina.

5) Capitolo 6: Identificazione del cofattore utilizzato dall' enzima ureidoglicolato idrolasi (AllA) di E.coli. L'idrolisi dell'ureidoglicolato a gliossilato è catalizzata da due diversi tipologie di enzimi: l'ureidoglicolato amidoidrolasi catalizza la conversione di questo composto ad anidride carbonica, ammonio e idrossi-glicina che si degrada spontaneamente a gliossilato rilasciando ammonio; l'ureidoglicolato amidinoidrolasi catalizza la conversione di questo composto direttamente a gliossilato e urea. I primi studi effetuati sull'enzima AllA di E.coli dimostrano che l'enzima è una amidinoidrolasi, ma studi successivi che ne presentano la struttura cristallograffica la presentano come amidoidrolasi e anche nelle banche dati è presente un pò di confusione sulla classificazione di AllA. E' stato confermato in questo lavoro che l'enzima è una amidino idrolasi ed è stata completata la caratterizzazione biochimica dell'enzima analizzandone la metallo dipendenza. L'enzima è risultato nichel dipendente.

Durante il dottorato ho trascorso 6 mesi presso la Freie Universität di Berlino presso il gruppo di ricerca del professor Claus Peter Witte dove ho partecipato alla realizzazione di due progetti:

6) Accumulo delle ureidi durante stress osmotico e salino in Arabidopsis thaliana. Durante questo progetto mi sono occupato di comprendere se l'accuomulo delle ureidi acido allantoico e allantoina in condizioni di stress è un fattore protettivo per la pianta, oppure un sintomo causato dallo stress .

7)Metodo per la purificazione su larga scala della Guanina deaminasi di A.thaliana. Sviluppo di un metodo su larga scala per la purificazione della gunosina deaminasi al fine di averne una quantità sufficiente per effettuare i test per la cristallizzazione.