Aspergillus flavus: controllo della biosintesi di aflatossina e strategie di biocompetizione

Abstract

L'aflatossina B1 è considerata una delle micotossine più pericolose per la salute dell'uomo e degli animali. La contaminazione di alimenti e mangimi che può verificarsi, a seguito dell’infezione fungina, in ogni fase del loro processo di trasformazione (dal campo alla tavola) è causa di gravi perdite economiche. Una delle strategie che attualmente è considerata tra le più promettenti nel contenere il "rischio aflatossine" consiste nell’uso della bio-competizione quale mezzo di prevenzione dell'infezione fungina delle colture in campo. Il biocontrollo realizzato tramite l’inibizione competitiva ad opera di ceppi atossigenici (afla-) di Aspergillus flavus ha dimostrato di essere un metodo efficace per il contenimento aflatossine in arachidi, mais e semi di cotone. Le popolazioni naturali di afla- sono considerate i serbatoi da cui selezionare i biocompetitori più forti; tuttavia, selezionare i ceppi migliori non è facile, sia per la scarsità di ceppi afla- efficaci che per le diverse condizioni ambientali che possono influenzare la loro efficacia in campo. Occorrono pertanto procedure “high throughput” in grado di vagliare un numero molto elevato di isolati per identificare i buoni competitori. Le prove in campo necessarie per valutare la loro efficienza una volta rilasciati nell’ambiente sono costose e laboriose, ma esperimenti di ricostruzione condotti in laboratorio possono essere utili sia per analizzare i meccanismi biologici alla base dell'efficacia dei ceppi afla- nel prevenire la biosintesi di aflatossina, sia per ottenere indicazioni preliminari sulle prestazioni degli stessi sulle colture. In questo lavoro è stata messa a punto una procedura semplice ed economica, che sfrutta fluorescenza UV-indotta della tossina, per valutare il potenziale di ceppi afla-, che colonizzano i campi di mais della pianura padana, nel ridurre l'accumulo di aflatossina; attraverso il processo di screening è stato isolato un ceppo afla- che si è dimostrato efficace nel contenere l’accumulo di aflatossina nei confronti di tutti i ceppi aflatossigenici (afla+) isolati. Il profilo genetico del buon competitore è stato caratterizzato, e la sua efficacia testata in campo nel corso di un trial di tre anni. Sono stati analizzati alcuni dei parametri che si sospetta siano coinvolti nell'efficacia della biocompetizione: i dati riportati dimostrano che sia il momento di inoculo del ceppo afla- che il rapporto tra afla- e afla+ sono cruciali. L'effetto della concentrazione dei conidi è stato invece valutato con esperimenti in micromanipolazione in cui spore singole afla- e afla+ sono state inoculate fianco a fianco sulla superficie di terreno agarizzato. La procedur, che si avvale di un lettore di fluorescenza di piastre multipozzetto, è stata utilizzata anche per valutare l'efficacia e la cinetica di azione di composti antiossidanti (o di miscele) sull'accumulo aflatossine: è stato testato l’effetto sia di composti puri (come acido α-lipoico, acido ascorbico e N-acetil-cisteina), sia di estratti vegetali (estratti organici di radici, stelo e foglia di Citrullus colocynthis), sia di estratti naturali commerciali (estratto di semi d’uva e di Ratania, Indena®). Infine, è stata dimostrata l'efficacia biocompetitiva di un ceppo naturale di Aspergillus oryzae, isolato da mais campionato in Madagascar, contro ceppi aflatossigenici di A. flavus.

Aflatoxin B1 is considered one of the most dangerous mycotoxin for humans and animals health. Moreover severe economic losses may be encountered due to its possible contamination of food and feed during each step of their transformation process (from field to table). Preventing fungal infection/ toxin contamination of crops in the field is considered the preferred strategy to cope with the “aflatoxin risk”. Biocontrol by competitive inhibition using atoxigenic (afla–) Aspergillus flavus strains has been shown to be an effective method in aflatoxin containment in peanuts, maize and cottonseed. Naturally occurring populations of afla– strains are considered reservoirs from which to select the strongest biocompetitors. However, the selection of biocontrol strains is not an easy task, due both to the small amount of afla– strains and to the various environmental conditions that may affect their efficacy in the field. High throughput procedures are therefore desirable to screen large amount of isolates in order to identify “good competitors”. Moreover, as field trials required to assess their efficiency are expensive and laborious, reconstruction experiments have been generally performed under laboratory conditions to investigate the biological mechanisms underlying the efficacy of afla– strains in preventing aflatoxin production and/or to give a preliminary indication of strain performance when released in the crops. Here, a simple and inexpensive fluorescence-based procedure is described: this is used to evaluate the potential of afla– strains, colonizing the corn fields of the Po Valley, in reducing aflatoxin accumulation; through the screening process an afla- strain is found to be a good competitor against all aflatoxigenic (afla+) strains isolated. The “good competitor” has been genetically characterized and his efficacy tested on crops during a three-years trial. We also analyzed some parameters for the competition efficacy: the data we reported showed that both the timing of afla– inoculation and the inoculum ratio between afla– and afla+ strains are crucial. The effect of conidia “crowding” was assessed with experiments performed by co-inoculation of spore suspensions or single spores of afla– and afla+ strains side by side on the surface of CAM plates. The fluorescence-based procedure is here also used to assess the efficacy and the time-course effect of antioxidants (or multiple combination of them) on aflatoxins accumulation: pure compounds (such as α-lipoic acid, ascorbic acid and N-acetyl-cysteine), botanicals (Citrullus colocynthis organic extracts from roots, stems and leaves tissues) and commercial standardized natural extracts (Indena® Ratania and grape seeds extracts) are tested. Moreover, we demonstrated the biocompetitive efficacy of an Aspergillus oryzae wild strain, isolated from maize commodities collected in Madagascar, against aflatoxigenic A. flavus strains: competition tests both with multiwell procedure and on maize kernels were conducted.