STRUCTURAL AND FUNCTIONAL TRAITS OF NG2/CSPG4 PROTEOGLYCAN IN RELATION TO ITS ROLE IN TUMORS

Abstract

Chondroitin Sulphate Proteoglycan-4 (NG2/CSPG4) is a transmembrane proteoglycan consisting of a N-linked glycoprotein of 280 kDa and a proteoglycan component of about 450 kDa. It is expressed on the surface of various types of immature progenitor cells and its expression decreases with terminal differentiation. NG2/CSPG4 is expressed in several human malignant tumors playing an important role in growth, migration, and metastatic dissemination of tumor cells and it is involved in promotion of tumor progression. Aberrant expression of NG2/CSPG4 on cancer cells and angiogenic vasculature is observed in association with an aggressive disease course in several malignancies. Moreover, NG2/CSPG4 is expressed on the surface of both tumor cells and pericytes, and its distribution in normal tissue can be considered relatively restricted, so to be considered an attractive candidate for simultaneously targeting the malignant and stromal cellular compartments within the tumour. NG2/CSPG4 can trigger rearrangements of the actin cytoskeleton and interacts with components of the extracellular matrix, playing a role in both growth control and motility of cells. The singularity of NG2/CSPG4 structure suggests that it might also be unique in terms of its ability to participate in inter- and intra-molecular interactions. As a membrane-spanning molecule, NG2/CSPG4 has the potential to interact with its cytoplasmic domain, the large extracellular portion, and the glycosaminoglycan chain it carries on the core protein to participate in signaling between the extracellular and intracellular compartments of the cell, guiding the activation of important survival and growth pathways in tumors. Because of its structure, distribution and functions, NG2/CSPG4 has been proposed to promote tumor progression by multiple mechanisms and may represent a putative target for molecular therapy against cancer. To obtain anti-NG2/CSPG4 monoclonal antibodies (mAbs) we performed a systematical production of mAbs with the hybridoma technology, where immunization has been performed employing the extracellular portion of recombinant NG2/CSPG4 protein and from this immunization 63 clones have been selected and they have been characterized. We employed these mAbs to establish the expression patterns and subcellular distribution of NG2/CSPG4 in tumor cells and tissues, and to investigate the existence of NG2/CSPG4 isoforms among different tumors. The reactivity of mAbs against NG2/CSPG4 expressed from different cells or tissues, let us hypothesize that diverse isoforms of NG2/CSPG4 are expressed among the different tumors. As NG2 may represents a putative target for cancer molecular therapy against cancer, we employed our panel of anti-NG2/CPSG4 mAbs as a useful instrument to study in vitro their effect, with the aim to select those able to interfere with the functions that NG2 plays in tumors cells growth, survival, adhesion, migration. NG2 seems to interact with many molecules with its cytoplasmic domain, the large extracellular portion, and the glycosaminoglycan chain it carries on the core protein. In this contests, the last part of this research focus on the study of NG2/CSPG4’s putative interactors, carried on through a proteomic approach with mass spectrometry on tumor cell lines. MALDI-TOF analysis let us confirm some of the interactors already demonstrated in literature, and interestingly we identified some important putative interactors never found before, involved in cell migration. This finding open new ways to our research in target therapy against tumors.

NG2/CSPG4 è un proteoglicano transmembrana costituito da una glicoproteina di 280 kDa e da una componente proteoglicanica di circa 450 kDa. E’ espresso sulla superficie di vari tipi di cellule progenitrici immature e la sua espressione diminuisce durante il differenziamento. E’ espresso in diversi tumori maligni nei quali svolge un ruolo centrale nella crescita, migrazione e diffusione metastatica del tumore e sembra favorire la progressione tumorale. L’espressione di NG2/CSPG4 risulta modulata nelle cellule tumorali e sui vasi angiogenici, e tale regolazione è spesso associata a un decorso aggressivo in vari tumori maligni. E’ diffuso sulla superficie sia delle cellule tumorali che dei periciti, e la sua distribuzione nel tessuto sano può essere considerata relativamente limitata, in modo da deputare NG2/CSPG4 come un candidato ideale per il targeting sia dei compartimenti cellulari maligni che stromali all'interno del tumore. NG2/CSPG4 in quanto transmembrana, può sia innescare riarrangiamenti citoscheletrici con il suo dominio citoplasmatico, che interagire con i componenti della matrice extracellulare mediante il dominio extracellulare, investendo un ruolo fondamentale sia nel controllo della crescita che della motilità delle cellule. Inoltre questo proteoglicano sfrutta per le sue interazioni anche la catena di condroitin solfato, di cui è fornito il core proteico, per reclutare interattori extracellulari o di membrana. Queste interazioni sembrano conferire ad NG2/CSPG4 un ruolo centrale nelle vie di segnalazione tra i compartimenti extra- ed intra-cellulari, guidando la sopravvivenza e la crescita delle cellule tumorali in cui risulta essere espresso. Per tanto, grazie alle sue peculiari caratteristiche di struttura, distribuzione, e le funzione, NG2/CSPG4 sembra essere un probabile promotore della progressione tumorale ponendosi quindi come bersaglio ottimale nella terapia molecolare contro il cancro. In tale contesto, per ottenere anticorpi monoclonali (mAbs) anti-NG2/CSPG4 abbiamo avviato nel nostro laboratorio una produzione sistematica di mAbs da ibridomi, ottenuti impiegando il dominio extracellulare della proteina come immunogeno. Da questa immunizzazione sono stati selezionati e caratterizzati 63 cloni e loro subcloni. Abbiamo utilizzato questi anticorpi monoclonali per studiare i pattern di espressione di diverse linee cellulari tumorali e la distribuzione subcellulare di NG2/CSPG4 in questi tipi di tumori, al fine di indagare l’esistenza di diverse isoforme NG2/CSPG4 espresse nei vari tipi di tumori. La variabilità con cui tali mAbs riconoscono il loro antigene, tra le diverse linee cellulari testate, fa ipotizzare che diversi tumori esprimono diverse isoforme di NG2/CSPG4. Siccome NG2/CSPG4 è stato proposto come putativo bersaglio per un’eventuale terapia molecolare traghettata contro melanoma, sarcoma, mesoltelioma e carcinoma mammario, abbiamo sfruttato il nostro pannello di anticorpi anti-NG2/CPSG4 per studiare le loro funzionalità in vitro con lo scopo di selezionare quelli in grado di interferire con le principali funzioni di NG2 nella crescita, sopravvivenza, adesione, e migrazione cellulare. Dato che NG2/CSPG4, con i suoi domini, sembra interagire con diverse molecole, una parte di questa ricerca è stata dedicata allo studio di tali eventuali interattori, che abbiamo condotto con un approccio proteomico mediante spettrometria di massa. Dai risultati ottenuti dalle analisi MALDI-TOF non solo abbiamo confermato alcuni degli interattori di NG2/CSPG4 già noti in letteratura, bensì abbiamo individuato nuovi interattori putativi, i quali risultano per lo più a loro volta coinvolti nei processi di migrazione cellulare e nell’organizzazione del citoscheletro. Questi risultati aprono la strada ad indagini più mirate, con lo scopo di caratterizzare la natura delle isoforme di NG2/CSPG4 e le loro diverse funzioni, e di approfondire le interazioni che tali molecole hanno in un contesto tumorale.