Metodi molecolari per la rilevazione di microrganismi negli alimenti e nell'ambiente

Abstract

Il ruolo dei microrganismi nella biosfera è di inestimabile importanza. Hanno conquistato tutte le possibili nicchie ecologiche e svolgono un ruolo primario, contribuendo come primi attori al ciclo degli elementi essenziali per la vita. I microrganismi sono anche una fonte di nutrienti, essendo alla base di tutte le catene alimentari ed ecologiche. La scienza biotecnologica moderna e le sue applicazioni si basano sulle proprietà microbiche e sull’impiego dei microrganismi e dei loro processi per scopi specifici e industriali. Anche se la maggior parte di essi apporta benefici all’uomo, in determinate situazioni essi possono provocare danni agli organismi viventi superiori. Per tutti questi motivi la microbiologia diagnostica, che si occupa dell’identificazione e della rilevazione dei microrganismi, riveste un ruolo sempre più importante. E’ noto ormai da tempo che i metodi classici non sono sufficienti a tale scopo, infatti per quanto siano stati studiati terreni di isolamento e arricchimento per i diversi microrganismi coinvolti nelle diverse vie metaboliche, solo una frazione di tali soggetti può essere coltivata in laboratorio e i tempi di analisi sono spesso lunghi. Lo scopo di questa tesi è stato mettere a punto tecniche molecolari per la rilevazione di batteri conosciuti e metodi di studio di comunità microbiche in un ambiente complesso, valutandone l’efficacia e la possibile applicazione reale. Due sono i casi presi in esame: - Salmonella enterica e Campylobacter jejuni nella carne di pollo; - la consistenza e la diversità della comunità microbica di sedimenti di un sistema fluviale eutrofico, in presenza-assenza della macrofita radicata Vallisneria spiralis. Salmonella enterica e Campylobacter jejuni sono microrganismi contaminanti la carne di pollo in grado di causare infezioni alimentari all’uomo, che può venirne a contatto per ingestione di materiale contaminato. L’EFSA (European Food Safety Authority) negli ultimi anni ha intensificato gli studi e le pubblicazioni relative a tali microrganismi patogeni, controllando l’insorgenza delle zoonosi e cercando di mettere a punto sistemi per lo sviluppo di metodi diagnostici per il loro rilevamento negli alimenti. Sulla base di queste indicazioni, nella prima fase del lavoro di tesi sono stati sviluppati e analizzati due metodi per identificare e quantificare S. enterica e C. jejuni, pollo basati su PCR Real Time, qualitativa e quantitativa (qPCR) in colture microbiche pure ed in campioni di pollo. Poiché i geni target sono presenti in singola copia nei rispettivi batteri, è stato assunto che ad ogni copia di amplicone corrispondesse un singolo cromosoma e, di conseguenza, una singola cellula batterica. Il primo metodo, messo a punto in precedenza nella Sezione di Genetica e Biotecnologie Ambientali del Dipartimento di Scienze Ambientali dell’Università di Parma, si basa sulla chimica del SYBR®Green e, in questo lavoro, è stato testato in un laboratorio diverso da quello originale e su macchine per Real Time PCR di marche diverse da quella su cui il metodo era stato messo a punto originariamente. La riproducibilità dei dati ottenuti dalle diverse macchine è stata valutata mediante il calcolo della deviazione standard relativa (RSDR), secondo le indicazioni del CODEX alimentarius e tramite. l’analisi della varianza. Il metodo per la quantificazione di Salmonella in campioni di pollo contaminati artificialmente con questo organismo, si è rivelato trasferibile da una macchina all'altra, anche se ad operare erano sperimentatori diversi. Per Campylobacter, invece, il metodo deve essere ulteriormente migliorato, in quanto solo uno dei campioni analizzati dava risultati riproducibili sulle due macchine utilizzate. Tuttavia, lo stesso metodo, provato presso una delle aziende leader nel campo della produzione e distribuzione di diversi prodotti di carne avicola, si è rivelato adeguato per la rilevazione qualitativa di Campylobacter. L’altro metodo per la rilevazione e la quantificazione di S .enterica e C. jejuni è stato messo a punto utilizzando le sonde TaqMan®, che, oltre a presentare una maggiore specificità rispetto al SYBR®Green, consentono di quantificare contemporaneamente due DNA target nella stessa reazione. I risultati delle analisi, condotte su colture pure dei due microrganismi e su campioni di pollo contaminati con essi, hanno mostrato una buona concordanza tra la qPCR in singolo ed in doppio e i convenzionali metodi microbiologici, per la maggior parte dei campioni analizzati, con un limite di rilevabilità pari a 103 CFU per campione in entrambi i casi. Nella seconda parte di questa tesi sono riportati i risultati di uno studio preliminare sulla consistenza e la diversità della comunità microbica del sedimento in un sistema fluviale eutrofico, in presenza o assenza della macrofita radicata V. spiralis. Lo scopo di questo lavoro è stato sviluppare degli strumenti di analisi che permettano di comprendere il ruolo della comunità microbica, associata al sistema radicale di Vallisneria, e coinvolta nel ciclo dell’azoto. Il lavoro sperimentale è stato svolto in collaborazione della Dott.ssa Elisa Soana (Dottoranda di Ricerca in Ecologia) e del Dott. Marco Bartoli (Università degli Studi di Parma, Dipartimento di Scienze Ambientali). Vallisneria spiralis è un macrofita radicata d’acqua dolce che ha la capacità di crescere in un sistema eutrofico, in condizioni di azoto e nutrienti non limitanti, e nonostante ciò, di trasferire ossigeno a livello radicale, caratteristica che altre macrofite d’acqua dolce ad oggi non hanno mostrato. L’interesse ecologico è indagare il ruolo delle comunità macrofitiche sommerse nella regolazione delle dinamiche biogeochimiche (con particolare riferimento al ciclo dell’azoto) e le relazioni con le comunità microbiche in ecosistemi acquatici caratterizzati da rapida evoluzione in termini di caratteristiche del substrato e disponibilità dei nutrienti inorganici. A tale scopo, lo studio relativo alle comunità microbiche ha inizialmente coinvolto l’isolamento delle specie batteriche, correlate al ciclo biogeochimico dell’azoto, da sezioni di sedimento vegetate da V. spiralis; la preparazione delle colture pure degli isolati batterici e la loro identificazione, attraverso tecniche molecolari. Questo è stato possibile attraverso l’estrazione del DNA genomico da ciascun isolato batterico, l’amplificazione del 16S rDNA, l’analisi dei profili ARDRA seguita dalla selezione dei profili diversamente rappresentati e il sequenziamento del 16S rDNA. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di ottenere dei microrganismi di riferimento, per analisi più dettagliate, come la determinazione dei profili ARISA. In parallelo, è stata svolta una ricerca bibliografica per la selezione dei geni batterici coinvolti nelle reazioni principali del ciclo biogeochimico dell’azoto e la selezione dei primer per la futura messa a punto di una Real Time PCR multiplex. Infine, la tecnica ARISA è stata applicata a sedimenti campionati da zone vegetate e sedimenti prelevati da zone non vegetate, in due momenti importanti per lo sviluppo della macrofita radicata (in fase esponenziale di crescita e alla massima produzione in termini di biomassa) per conoscere ed evidenziare possibili differenze sulla popolazione microbica totale. I risultati ottenuti, sottoposti ad un’approfondita analisi statistica, hanno dimostrato che la presenza di V. spiralis influisce, seppur in modo limitato, sulla diversità microbica, soprattutto in base allo stadio di sviluppo della pianta stessa.M

The role of microorganisms in the biosphere is invaluable. They thrive in all possible niches and play a primary role, contributing to the recycling of the essential elements for life. Microorganisms are also a source of nutrients, being at the root of all ecological food chains and networks. The modern biotechnology science and its applications are based on microbial properties and on the use of microorganisms and their processes for specific and industrial purposes. Even though most of them are beneficial to man, in certain situations they can cause damage to higher living organisms. For all these reasons, the diagnostic microbiology, dealing with identification and detection of microorganisms, plays an increasingly important role. It has long been known that the classical methods are not sufficient for this purpose, in fact, although various isolation and enrichment media have been studied for growing microorganisms involved in different metabolic pathways, only a fraction of these can be cultivated in the laboratory and analysis times are often long and tedious. The purpose of this thesis was to develop molecular techniques for detection of well characterized bacterial species, as well as methods for studying microbial communities in complex environments, assessing the effectiveness and applicability of the methods. Two cases have been studied: • Salmonella enterica and Campylobacter jejuni in chicken meat; • the consistency and diversity of microbial community in the sediment of an eutrophic river system, in the presence, or absence of the rooted macrophyte Vallisneria spiralis. Salmonella enterica and Campylobacter jejuni are microorganisms contaminating the poultry meat, that can cause food-borne infections to humans, which may come into contact by ingestion of contaminated material. EFSA (European Food Safety Authority) has intensified in recent years, studies and publications related to these pathogens, controlling the occurrence of zoonoses and trying to develop systems for the implementation of diagnostic tools to monitor their presence in food. By following these guidelines, in the first phase of the thesis two methods, based on qualitative and quantitative Real Time PCR (qPCR), have been developed and tested to identify and quantify S. enterica and C. jejuni in pure cultures and in chicken samples. Since the target genes are present in single copy in the respective bacteria, it was assumed that each copy of amplicon corresponded to a single chromosome and, consequently, to a single bacterial cell. The first method, previously developed in the Division of Genetics an Environmental Biotechnology of the Department of Environmental Sciences (University of Parma), is based on SYBR®Green, and in this work was tested in a different laboratory from the original, with real-time PCR equipments of brands different from those on which the method was originally developed. The reproducibility of the data obtained with the different equipments was evaluated by calculating the relative standard deviation (RSDR), as indicated by the Codex Alimentarius and by the variance analysis. The method for the quantification of Salmonella in artificially contaminated chicken samples with this organism, has proved transferable from one equipment to another, even if different operators have worked. For Campylobacter, the method should be further improved, since only one of the samples analyzed gave reproducible results on the two equipments used. However, the same method, tested at one of the leading companies in the poultry food chain, has proved to be suitable for the qualitative detection of Campylobacter. A system for the detection and quantification of S. enterica and C. jejuni has also been developed using TaqMan ® probes, which, not only have higher specificity than the SYBR®Green but allows to quantify simultaneously two target DNA in the same reaction. The results of the analysis conducted on pure cultures of microorganisms and samples of chicken contaminated with them, showed a good consistence between single-and double-qPCR and conventional microbiological methods, for most of the samples analyzed. Very interesting result is the ability to simultaneously detect, 10 copies of genomic DNA of S. enterica and C. jejuni, equal to 103 CFU / ml. Results of a preliminary study on consistency and diversity of microbial community in the sediment of an eutrophic river system, in the presence, or absence of the rooted macrophyta Vallisneria spiralis are shown in the second part of this dissertation. Aim of this work was to develop analysis tools to be used for understanding the role, on nitrogen recycling, of the microbial community, associated to the root system of Vallisneria. The experimental work was done in collaboration with Dr. Elisa Soana (PhD student in Ecology) and Dr. Marco Bartoli (University of Parma, Department of Environmental Sciences). Vallisneria spiralis is a rooted freshwater macrophyte with the ability to grow in a eutrophic system, and yet under not limiting conditions of nitrogen and nutrients, to transfer oxygen to the root level, a feature, so far, never shown by other freshwater macrophytes. The ecological interest of this investigation is to understand the role of submerged macrophytic communities in the regulation of biogeochemical dynamics (with particular reference to the nitrogen cycle) and relations with the microbial communities in aquatic ecosystems characterized by rapid evolution in terms of substrate characteristics and availability of inorganic nutrients. To this end, the study of microbial communities has initially involved the isolation of bacterial species, partecipating to nitrogen cycle, from the sediment vegetated by V.spiralis; the preparation of pure cultures of the isolated bacteria and their identification, by molecular techniques. This was possible by genomic DNA extraction from each bacterial isolate, amplification of 16S rDNA, analysis of ARDRA profiles, followed by selection of uniquely represented patterns and sequencing of their 16S rDNA. The aim of this work was to obtain reference microorganisms for more detailed analysis, such as ARISA profiles. In parallel, a bibliographic search was performed in order to select bacterial genes involved in the major reactions of biogeochemical cycle of nitrogen and select primers for the future development of a multiplex real-time PCR. Finally, the ARISA technique was applied to sediments sampled either from vegetated, and not vegetated areas, collected in two important steps during the development of the macrophyte (in exponential phase of growth and maximum production in terms of biomass)with the aim of highlighting possible differences on the total microbial population. The results obtained, and subjected to accurate statistical analysis, evidentiated that the presence of V. spiralis affects, albeit in a limited way, the microbial diversity, in particular according to the stage of plant development.