Probing quality and safety of tomato products by genomic and proteomic tools

Abstract

La presente tesi di dottorato riguarda l’utilizzo di tecniche avanzate di genomica e proteomica per la valutazione della qualità e della sicurezza di una delle più importati e rinomate colture tradizionali italiane: il pomodoro. Nella prima sezione, approcci innovativi di proteomica sono stati applicati al problema delle allergie al pomodoro. Tecniche immunologiche classiche, basate sull’elettroforesi su gel per la separazione delle proteine, affiancate da sistemi di spettrometria di massa avanzati, sono state applicate ad un set di 12 ecotipi di pomodoro, consentendo l’identificazione e la caratterizzazione dei principali allergeni. Inoltre, sono state individuate e caratterizzate diverse isoforme della proteina allergenica del pomodoro Lipid Transfer Protein (LTP), sia negli estratti di buccia che di semi di pomodori comuni, mediante tecniche di spettrometria di massa ad alta risoluzione accoppiate a strategie di purificazione classiche ed innovative. Nella seconda sezione, tecniche di genomica avanzata sono state applicate alla questione dell’identificazione varietale in pomodoro. In particolare, è stata effettuata la discriminazione di sette varietà di pomodoro mediante l’utilizzo di sonde specifiche, chiamate acidi peptido nucleici (PNAs), che riconoscono SNP caratteristiche del pomodoro. Dopo che le prestazioni di PNA diversamente modificati (2D- and 5L- chiral-box), in termini di affinità di legame e di riconoscimento di mismatch, sono state testate e confrontati con quelle del PNA chirale, sia in soluzione che su superficie, il miglior modello di PNA è stato utilizzato per il design di un microarray basato sui PNA e per lo sviluppo di un sistema PNA-mediated PCR clamping per il riconoscimento di SNP specifiche del pomodoro.

The present Ph.D. thesis deals with the use of advanced genomic and proteomic techniques for the assessment of quality and safety of one of the most important traditional and worldwide renowned Italian crop products: tomato. In the first section, innovative proteomic approaches have been applied to the issue of tomato allergy. Classical immunological techniques, based on gel electrophoresis for the separation of proteins, along with advanced mass spectrometric systems, have been applied to a set of 12 tomato ecotypes, allowing the detection and the characterization of the main allergens. Moreover, several novel isoforms of allergenic tomato Lipid Transfer Protein (LTP) have been detected and characterized, both in peel and in seed fractions of common tomatoes, by means of high-resolution mass spectrometric techniques, coupled with classic and innovative purification strategies. In the second section, advanced genomic techniques have been applied to the problem of tomato variety identification. In particular, the discrimination of seven tomato varieties has been achieved by means of specific probes, namely Peptide Nucleic Acids (PNAs), recognizing characteristic tomato SNPs. After that the performances, in terms of binding affinity and mismatch recognition, of different modified PNAs (2D- and 5L- chiral-box) have been tested and compared to fully ‘achiral’ PNA, both in solution and on solid surfaces, the best PNA model was exploited in the design of a PNA-based microarray and in a PNA-mediated PCR clamping system for the recognition of tomato specific SNPs.