SDH assembly in S. cerevisiae: focus on the functional role of SDH6

Abstract

La succinato deidrogenasi (SDH) o complesso II è un enzima chiave del ciclo di Krebs e della catena respiratoria mitocondriale. E’ una ferro zolfo flavo proteina che catalizza l’ossidazione del succinato a fumarato con relativo passaggio degli elettroni dal FADH2 attraverso i tre centri Fe-S e infine all’ubichinone che viene ridotto ad ubichinolo. L’enzima, ubiquitario in tutte le specie, è un eterotetramero, di 124 kDa, composto da quattro sub-unità che sono codificate da altrettanti geni nucleari, SDHA-D nei mammiferi (corrispondenti ai geni SDH1-4 in lievito). E’ noto che difetti nelle diverse subunità dell’enzima sono associate a patologie differenti in relazione a quale gene è mutato. Infatti mentre mutazioni germinali in SDHA sono associate ad una patologia neurodegenerativa, la Sindrome di Leigh, mutazioni a carico di SDHB, SDHC, SDHD predispongono alla formazione di forme tumorali quali paragangliomi o feocromocitomi. Sebbene la struttura e la funzione del complesso SDH siano note da anni, poco si sa circa il suo assemblaggio. Solo recentemente sono stati descritti due nuovi fattori, SDHAF1(SDH6 in lievito) e SDHAF2 (SDH5) che hanno un ruolo evolutivamente conservato e dedicato nell’assemblaggio del complesso II. Anche mutazioni a carico dei geni che codificano per questi due fattori di assemblaggio sono associate a patologie diverse: disturbi mitocondriali e cancro. Il primo assemblatore specifico per la succinato deidrogenasi, Sdh6p, Sdhaf1p nell’uomo, è stato scoperto in seguito ad uno studio, compiuto presso l’Istituto Neurologico C.Besta dal gruppo di ricerca del Dott. M. Zeviani, su bambini affetti da leucoencefalopatia progressiva, associata ad una significativa diminuzione sia di attività enzimatica SDH che dei livelli di enzima SDH, supportato da studi eseguiti in lievito (Ghezzi et al., 2009). L’analisi di sequenza ha individuato due mutazioni missenso R55P e G57R in una regione, chiamata LOC644096, che codifica per un putativo prodotto genico di 115 aminoacidi a funzione sconosciuta. Allo scopo di valutare se le mutazioni missenso che cosegregavano con la patologia fossero effettivamente responsabili della diminuita attività del complesso II, è stato utilizzato il lievito come sistema modello. Numerosi studi hanno infatti dimostrato che questo organismo è un ottimo modello sia per studiare gli effetti primari delle mutazioni patogene che per determinare i meccanismi molecolari che inducono patologie mitocondriali. Il lievito presentava un putativo ortologo del gene umano, anche esso a funzione sconosciuta che codifica per una piccola proteina di 79 aa: YDR379c-a. L’allineamento delle due sequenze ha evidenziato come l’identità condivisa tra le due sequenze fosse del 21% e come i residui coinvolti nelle due mutazioni, R55P e G57R fossero conservati. Gli studi funzionali condotti nel lievito e in linee cellulari umane hanno indicato che la proteina identificata sia richiesta per l’assemblaggio e il corretto funzionamento del complesso II, dal momento che la sua mancanza determina una drastica riduzione della attività succinato deidrogena sica. Quale sia però il ruolo biochimico di Sdh6 nel processo di assemblaggio della SDH non è ancora stato chiarito. Obiettivo del seguente lavoro di ricerca è stato quello di contribuire alla comprensione della funzione di questo fattore utilizzando approcci genetici e biochimici. Sdh6p è caratterizzata dalla presenza di un motivo LYR che ci ha spinto ad indagare il ruolo di questa proteina nell’inserimento dei centri Fe-S nel backbone del complesso II. Questi motivi proteici difatti sono una signature per proteine coinvolte nel metabolismo dei clusters Fe-S. Sdhp6 inoltre, presenta una significativa similarità di sequenza con Isd11p, proteina nota essere necessaria per la biogenesi dei clusters Fe-S. Sulla base di tali considerazioni si è deciso di valutare se ISD11 in multi copia potesse ripristinare il fenotipo OXPHOS del mutante sdh6 e viceversa. I risultati indicano che la somiglianza strutturale tra i due geni non è accompagnata da una qualche omologia funzionale. E’ stato poi analizzato se SDH5 e TCM62, codificanti gli altri due fattori di assemblaggio del complesso II, espressi in multi copia ripristinassero la crescita ossidativa del mutante sdh6 e viceversa. In nessun caso si è ottenuto il rescue del fenotipo di crescita. In seguito sono state overespresse nel mutante nullo le quattro subunità SDH per valutare se questo potesse incrementare l’attività SDH. A differenza di quanto osservato nel ceppo parentale in cui l’attività SDH aumentava del 50% nel ceppo Δsdh6 che overesprime l’intero complesso non è stato osservato alcun incremento dell’attività SDH. Questo dato ha suggerito come Sdh6p sia un rate limiting factor nel processo di assemblaggio del complesso II.

Risultati relativi alla determinazione del valore di Km per il succinato, uguale tra mutante e wild-type, hanno suggerito come l’abbattimento specifico dell’attività SDH nel mutante sdh6 sia dovuto ad un ridotto numero di unità enzimatiche piuttosto che ad un’alterazione qualitativa del complesso. Per aver ulteriore conferma di ciò sono stati dapprima valutati in SDS-PAGE i livelli di Sdh1p e Sdh2p nel ceppo Δsdh6. In secondo luogo è stato valutato lo stato di assemblaggio del complesso in condizioni native attraverso una BN-PAGE. I risultati ottenuti hanno consentito di affermare che la ridotta attività SDH misurata nel mutante è imputabile ad una riduzione del complesso SDH correttamente assemblato. Per valutare se Sdh6p contattasse il complesso o intermedi di questo o altri complessi molecolari sono state costruite delle varianti di Sdh6p taggate sia con l’epitopo HA che con la coda di istidine. I risultati ottenuti suggeriscono che Sdh6p non è associato né al complesso SDH né ad alcun complesso molecolare in quanto migra in forma monomerica. Utilizzando Sdh6 His-tag, sfruttando le interazioni tra Ni-NTA e i residui di 6HIS inseriti nella proteina, è stato dimostrato che Sdh6p non interagisce né con la subunità Sdh1 né con Sdh2. Parallelamente per cercare di ottenere maggiori informazioni circa il ruolo funzionale di SDH6 è stata intrapresa una ricerca di soppressori multi copia nel mutante nullo Δsdh6. Questo screening ha portato all’identificazione di due geni, YAP1 e YAP2 codificanti due fattori di trascrizione coinvolti in diversi processi cellulari. Tuttavia il rescue del difetto OXPHOS non era accompagnato da un ripristino dell’attività SDH. Questo risultato ha suggerito che Sdh6p svolgesse un altro ruolo nella cellula. Peraltro l’osservazione che diversi mutanti sdh, aventi la stessa attività residua SDH crescessero meglio su fonti di carbonio ossidabili rispetto al mutante sdh6, rafforzava l’ipotesi relativa ad un duplice ruolo di Sdh6p. Per capire in quale modo potesse agire il meccanismo di soppressione esercitato da Yap1p e Yap2p e quindi avere qualche indicazione circa l’altro ruolo di Sdh6 sono state eseguite alcune sperimentazioni sulla base di due funzioni svolte da Yap1 eYap2: risposta allo stress ossidativo e metabolismo del ferro. L’insieme dei risultati ottenuti favoriscono l’ipotesi che il meccanismo di soppressione esercitato da YAP1 e YAP2 sia da attribuire al loro ruolo legato al metabolismo/omeostasi del ferro. Infatti l’aggiunta di ferro al terreno di crescita consente il rescue del fenotipo OXPHOS nel mutante Δsdh6 non accompagnato da un incremento dell’attività SDH. Pertanto i risultati ottenuti suggeriscono che il secondo ruolo di Sdh6p possa essere correlato al metabolismo del ferro.

Yeast is a well recognised model for the study of human mitochondrial pathologies thanks its exceptionally ability to survive without a functional mitochondrial respiratory metabolism, provided that a fermentable carbon source is made available. Succinate dehydrogenase (SDH, complex II) is a conserved mitochondrial enzyme of the inner membrane that catalyzes the oxidation of succinate to fumarate during TCA cycle, using at the same time the reducing equivalents in the electron transport chain (ETC). Despite the extensive knowledge of the structural and catalytic properties of the complex, only two assembly factors specific for the SDH complex has been recently found: SDHAF1 and SDHAF2. The SDHAF1 gene was identified in humans as linked to infantile leukoencephalopathy. A yeast strain deleted in SDH6, the SDHAF1 ortholog, was OXPHOS incompetent, due to a severe and specific reduction of SDH activity. However, the Km value for succinate was similar in wild-type and in the null mutant, suggesting that defective SDH activity was caused by reduced number of enzyme units rather than by qualitative alterations of complex II. We have given more insights into the knowledge of SDH6 through genetic and biochemical studies performed in S. cerevisiae. Affinity purification analyses have shown that Sdh6p is not a physical interactor of subunit 1 and 2 of SDH complex. Furthermore Sdh6p is not part of complex II or other molecular complexes, as shown in BN-PAGE analyses. Moreover, Sdh6p is a rate limiting factor of SDH assembly: indeed despite the overexpression of all four SDH subunits in the null mutant the SDH activity is not restored unlike what occurred in the wild type strain suggesting the pivotal role of this protein in the complex II assembly. The results obtained in this work suggested that SDH6 plays a different role from that played by SDH5, the yeast ortholog of SDHAF2. Indeed the overexpression of SDH6 did not rescue the OXPHOS defect of Δsdh5 and viceversa. Therefore the two SDH specific assembly factors are not interchangeable. The presence of a LYR motif in the Sdh6 protein prompted us to investigate a putative role in the insertion of Fe-S clusters in complex II. Isd11p, a protein involved in the iron-sulfur biogenesis, shares a significant sequence similarity with Sdh6p and contains a LYR motif. We tried to rescue the OXPHOS deficient phenotype of sdh6 mutant by overexpressing ISD11 but the results obtained indicated that the two proteins do not share similar functions. To further investigate the functional role of SDH6 a search for multicopy suppressors was performed. This analysis identified YAP1 and YAP2, two transcription factors involved in several cellular processes. Although YAP1 and YAP2 are able to rescue the OXPHOS defect of sdh6 mutant, their action is not exerted by increasing the SDH activity. Their suppression mechanism seems to be independent of complex II. Thus Sdh6p might have an additional role besides the SDH assembly: if this is the case the OXPHOS negative phenotype of sdh6 null mutant would be due to both a reduced SDH activity and to a lack of some other putative function. The observation that several sdh mutants with a 30-40% of residual SDH activity are able to grow on oxidative carbon sources much better than Δsdh6 strengthens this hypothesis. In order to understand the mechanism of suppression exerted by YAP1 and YAP2 we focused on two main functions linked to these genes: the oxidative stress and the iron metabolism. All together these analyses favor the hypothesis that YAP1/YAP2 suppression mechanism could be mainly ascribed to their role in iron metabolism/homeostasis. Moreover when the effects of iron supplementation on the oxidative growth of the Δsdh6 strain were tested a rescue of the OXPHOS phenotype was observed without any increase of SDH activity. The results obtained support the view that the second role of Sdh6p could be related to iron metabolism/homeostasis.