Identificazione funzionale su scala genomica degli attivatori trascrizionali di due funghi filamentosi simbiotici

Abstract

Nel mio lavoro di dottorato, una parte del quale rientra in un progetto di ricerca internazionale (“TuberGenomics”) di cui fa parte il laboratorio in cui ho lavorato, mi sono occupata dell’analisi degli attivatori trascrizionali codificati dal genoma di due funghi filamentosi simbiotici Tuber melanosporum, un ascomicete filamentoso ipogeo produttore di corpi fruttiferi pregiati (“tartufi”), e di Laccaria bicolor, un basidiomicete. Questi organismi sono gli unici funghi simbiotici il cui genoma è stato sequenziato. Inoltre mi sono occupata anche dell’analisi degli attivatori della trascrizione del pioppo Populus trichocarpa, la pianta con cui Laccaria instaura la simbiosi. Lo scopo principale della ricerca è stata l’identificazione mediante approcci informatici di tutti i potenziali fattori di trascrizione presenti nel genoma di questi funghi e l’isolamento di alcuni attivatori della trascrizione mediante screening funzionale nel lievito Saccharomyces cerevisiae. L’analisi in silico si è basata sulla ricerca di omologia con fattori di trascrizione già noti in altri organismi e sulla catalogazione in famiglie degli stessi incentrata sui domini di legame al DNA. In T. melanosporum sono stati identificati mediante analisi in silico 201 fattori di trascrizione (TF), di cui 102 ortologhi a TF a funzione nota, 57 omologhi a fattori di trascrizione a funzione sconosciuta e 42 unici di Tuber mentre in L. bicolor sono stati identificati 215 fattori di trascrizione. Per validare funzionalmente alcuni di questi TF e per scoprire nuovi attivatori della trascrizione si è eseguito il Transcriptional activator trap (TAT) uno screening genomico-funzionale, basato su una variante del sistema del doppio ibrido nel lievito Saccharomyces cerevisiae, che è stato effettuato su librerie a cDNA corrispondenti alle tre fasi del ciclo vitale di Tuber melanosporum e Laccaria bicolor e alla radice del pioppo. Le ORF contenute nelle genoteche a cDNA sono state fuse al dominio di legame al DNA (DBD) di Gal4 mediante l’utilizzo del sistema Gateway® e usate per la trasformazione di un ceppo di lievito contenente tre geni reporter (HIS3, URA3 e LacZ) posti sotto il controllo di una Upstream Activating Sequence (UASGal) riconosciuta dall’attivatore Gal4. Le proteine di fusione Gal4-DBD-Tuber ORF vengono localizzate nel nucleo (grazie ad un NLS presente all’interno del DBD di Gal4) e se la componente di Tuber è in grado di attivare la trascrizione dei geni reporter vengono classificate come auto-attivatori. Per quanto riguarda Tuber in totale sono stati sequenziati gli inserti di 438 cloni risultati positivi al saggio (160 da micelio, 126 da corpo fruttifero, 152 da ectomicorriza) corrispondenti a 141 sequenze uniche. Tra queste sequenze ne riconosciamo 100 di fungo mentre le altre 41, come atteso, appartengono a pianta. Tra le sequenze di fungo 44 possiedono un DBD (DNA binding domain) e quindi sono state catalogate come putativi fattori di trascrizione, questo risultato ci ha permesso di validare un quarto dei fattori di trascrizione predetti in silico. Le altre invece non posseggono un DBD riconoscibile e vengono classificate come unconventional activators (UAs) se hanno una localizzazione nucleare o mista (nucleo/citoplasma) con un documentato ruolo nella attivazione della trascrizione (20 proteine identificate) oppure putative unconventional activators (PUAs) se non posseggono un ruolo documentato nella trascrizione (43 sequenze). Tra le 41 sequenze di pianta 22 posseggono un DBD e tra queste ritroviamo fattori di trascrizione coinvolti nell’interazione pianta-patogeno, 1 sequenza appartiene alla categoria UAs mentre le restanti 18 sono PUAs. Per Laccaria sono stati sequenziati 595 cloni di cui 408 di fungo e 187 di pianta che sono state organizzate in 83 contigs e 137 singletons, per un totale di 220 sequenze uniche di cui 80 di Laccaria e 140 di pianta. Delle 80 sequenze uniche di Laccaria, 19 sono rappresentate da fattori trascrizionali poiché contengono un DNA binding domain mentre le restanti 61 sequenze positive mancano di DBD noto. Tra queste si ritrovano 14 sequenze che vengono definite “Nuclear protein and Unconventional activators” (UAs) simili a geni che esprimono proteine con localizzazione nucleare o mista nucleare/citoplasmatica per le quali un ruolo diretto o indiretto nella regolazione della trascrizione è stato precedentemente dimostrato. Tra le altre sequenze prive di un DBD 31 ricadono nella categoria “Putative unconventional activators” (PUAs) poiché in letteratura non è noto un loro ruolo nella trascrizione. Le restanti 16 sequenze fanno parte delle proteine secrete tra cui 5 possiedono un dominio di localizzazione nucleare. Tra le 140 sequenze di pianta si isolano 61 proteine contenenti un DBD e 79 proteine prive di un DBD noto. All’interno di questa categoria ritroviamo 26 UAs e 53PUAs. Alcune delle sequenze così isolate possono essere dei falsi positivi dovuti alla presenza, all’interno del vettore utilizzato, del segnale di localizzazione NLS di Gal4. Infatti, a seguito della forzata localizzazione nucleare della proteina di fusione, possono venire identificate come attivatori trascrizionali anche proteine che, prive di un NLS, svolgono normalmente ruoli extra-nucleari. È dunque importante stabilire se le proteine per le quali non è mai stata riportata una azione/localizzazione nucleare e le proteine a funzione ignota sono effettivamente dotate di un NLS autonomo tale da giustificarne un possibile ruolo come attivatori trascrizionali. A tale scopo ho utilizzato il saggio di Nuclear transportation trap (NTT) basato sull’espressione di una proteina di fusione tra un fattore di trascrizione artificiale privo del segnale di localizzazione nucleare e la proteina di interesse. Se quest’ultima possiede un NLS funzionale il prodotto di fusione entra nel nucleo e attiva la trascrizione dei geni reporter LacZ e HIS3 posti a valle di un sito operatore riconosciuto dal fattore di trascrizione artificiale. Dopo una prima fase di messa a punto, ho effettuato il saggio NTT su un totale di 15 sequenze appartenenti a Tuber e su due proteine di Laccaria. Tra le proteine di Tuber sono state saggiate sequenze che codificano per sei enzimi del metabolismo che potrebbero rappresentare buoni candidati per l’isolamento di nuove moonlighting protein, due chinasi, Maf1 e Ste50, la calcineurina, la perossina 20, l’actina, la proteina Ltv1 e due proteine uniche di Tuber a funzione sconosciuta. Come controllo positivo si è utilizzato il fattore di trascrizione MetR. Di queste proteine 8 risultano avere un segnale di localizzazione: MetR, una proteina unica di Tuber, Maf1, Ltv1, Pex20, e 3 enzimi metabolici. Per quanto riguarda le proteine secrete di Laccaria non si sono ottenuti risultati positivi. E’ stata quindi messa a punto una efficace strategia per l’isolamento di cDNA codificanti per attivatori trascrizionali. Tale strategia ci ha permesso di validare una parte dell’annotazione in silico, ma ha anche portato alla identificazione funzionale di proteine ipotetiche e alla scoperta di nuovi fattori di trascrizione. Dal momento che, almeno per il tartufo, sono già stati validati sperimentalmente alcuni TF maggiormente espressi in ectomicorriza o corpo fruttifero unici di Tuber, è di enorme interesse identificare i geni su cui agiscono, e quindi il loro sito di legame al DNA. A questo scopo, mi sono occupata della messa a punto della metodica di bacterial one hybrid (B1H) che consente di determinare la specificità di legame ad una sequenza di DNA da parte di un fattore di trascrizione di interesse. Questo sistema sfrutta tre componenti: un vettore esca che consente l’espressione di un fattore di trascrizione fuso alla subunità omega della RNA polimerasi batterica, un vettore contenente una library di oligonucleotidi di 20bp a sequenza casuale posti a monte dei geni reporter URA3 e HIS3 (espressi nel medesimo cistrone) e un appropriato ceppo batterico in cui i geni omologhi a URA3 e HIS3 sono stati deleti. Se il fattore di trascrizione espresso lega una sequenza della library è in grado di attivare l’espressione del gene reporter HIS3 e quindi conferisce la capacità ai batteri di crescere in piastre contenenti terreno selettivo addizionato di 3-amino-triazolo (3AT). Nella prima parte della messa a punto del metodo mi sono occupata della progettazione, della costruzione della libreria e della sua propagazione in batterio. Successivamente è stata eseguita la ripulitura della library per eliminare quei cloni che attivano l’espressione dei geni reporter in modo indipendente dal fattore di trascrizione (esca) mediante selezione negativa su terreno selettivo contenente acido 5-fluoro-orotico (5-FOA), il 5-FOA viene convertito in un composto tossico per le cellule se il gene URA3 è espresso. La selezione del motivo di legame al DNA viene eseguita trasformando il ceppo batterico, in cui è stato precedentemente clonato il fattore di trascrizione, con la library ripulita ed eseguendo una selezione positiva dei cloni che attivano l’espressione del gene reporter HIS3 su terreno selettivo contenente 3AT. Una volta ottenuta la sequenza degli oligonucleotidi da 20bp isolati si utilizzano programmi bioinformatici per identificare il motivo di DNA a cui si lega il TF. Successivamente è necessaria una ricerca di questo motivo sul genoma dell’organismo per determinare i geni che vengono regolati dal TF in esame. La strategia è stata messa a punto utilizzando un controllo positivo che ci è stato fornito con il materiale del B1H e si è eseguito lo studio di fattori di trascrizione e di una proteina appartenente alla categoria PUA la fosfoadenosina fosfosolfato reduttasi di T. melanosporum. Tra i fattori di trascrizione presi in esame sono presenti due TF coinvolti nel metabolismo dell’azoto TmelNirA-1e TmelNirA2 e TF unici di Tuber, maggiormente espressi in ectomicorriza o corpo fruttifero, che non hanno una funzione nota. A seguito di tali esperimenti è stata possibile l’identificazione di un motivo di legame al DNA solamente per il fattore di trascrizione NirA2 e per un fattore unico di Tuber che risulta up-regolato nell’ectomicorriza.

La parte del lavoro riguardante l’analisi in silico e lo screening mediante Transcriptional activator trap dei fattori di trascrizione codificati dal genoma di T. melanosporum è già stata pubblicata nell’articolo “Genome-wide search and functional identification of transcription factors in the mycorrhizal fungus Tuber melanosporum” B.Montanini, E. Levati et al; New Phytologist (2010)