Verso un vaccino autoadiuvante multivalente contro il virus del papilloma umano

Abstract

La scoperta che l’infezione persistente da tipi oncogeni del virus del papilloma umano (HPV) è causa necessaria per l’insorgenza di neoplasia cervicale ha guidato lo sviluppo di strategie di prevenzione primaria. Nonostante la dimostrata efficacia dei vaccini attualmente in commercio contro infezioni dai sierotipi più comuni di HPV, la limitata multivalenza contro tipi virali non inclusi nelle formulazioni, l’elevato costo di ciascuna dose e la necessità di personale paramedico per la somministrazione, rendono necessario lo sviluppo di preparati di seconda generazione. La presente ricerca, nata dalla collaborazione tra il Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell’Università degli Studi di Parma, ‘International Agency for Research on Cancer’, WHO (Lione) e ‘German Cancer Research Center’ (Heidelberg), si è posta come obiettivo lo sviluppo di un vaccino economico, stabile e in grado di fornire una protezione a lungo termine a livello mucosale contro la maggiorparte dei tipi oncogeni di HPV. Nella prima fase della ricerca è stata esaminata l’immunogenicità e il potenziale di neutralizzazione virale di sei peptidi appartenenti alla regione N-terminale della proteina capsidica minore L2 (aa 1-120) di HPV16, utilizzando la proteina batterica Tioredossina (Trx) come scaffold strutturale. La strategia TDMI (Thioredoxin Displayed Multipeptide Immunogens) utilizzata, ha permesso l’identificazione dell’antigene ricombinante trimerico Trx-L2(20-38) come il miglior candidato per lo sviluppo di un vaccino cross-protettivo. Questo infatti si è rivelato un eccellente immunogeno, in grado di indurre non solo una forte risposta immunitaria, ma anche la produzione di anticorpi a protezione crociata in grado di neutralizzare fino a quattro diversi sierotipi virali, inclusi quelli a più alta cancerogenicità (HPV 16, 18, 58, 45). Avendo identificato l’antigene più promettente, la fase successiva ha riguardato l’ulteriore ottimizzazione dello stesso in vista di una sua utilizzazione come vaccino peptidico ricombinante. La dimostrazione che la porzione di epitopo effettivamente riconosciuta dagli anticorpi monoclonali, prodotti a partire dai topi precedentemente immunizzati, era quella compresa tra gli aminoacidi 20 e 31, ha portato alla generazione di antigeni ‘miniaturizzati’ costituiti dalla fusione della Trx con più copie dell’epitopo ridotto, con l’obiettivo di indurre una maggiore focalizzazione del sistema immunitario e quindi di potenziare ulteriormente la performance del vaccino in termini di cross-neutralizzazione. Con lo stesso scopo, sono state progettate proteine potenzialmenti multivalenti, presentanti diverse combinazioni strutturali dell’epitopo candidato di differenti sierotipi virali. Nota l’importanza di particolari ponti disolfuro per l’infettività dei virioni, è stata inoltre valutata l’immunoreattività dei monoclonali verso la forma ossidata o artificialmente ridotta dell’antigene Trx-L2(20-38) in esame, al fine di incrementare il potere neutralizzante degli anticorpi generati. L’ulteriore miglioramento dell’immunogeno candidato è stato diretto alla realizzazione di derivati ad elevata stabilità termica e conformazionale, con costi di produzione il più possibile ridotti, in grado di garantire una risposta immunitaria di lunga durata, con un numero minimo di somministrazioni. Tali obiettivi sono stati perseguiti valutando, da una parte, le proprietà di scaffold molecolare di varianti della Tioredossina provenienti da batteri ipertermofili, dall’altra esaminando la performance immunologica, soprattutto in termini di immunogenicità e capacità autoadiuvante, di proteine chimeriche contenenti forme modificate della Trx fuse alla Flagellina (Fli), uno dei più potenti stimolatori dell’immunità innata. Oltre alla fusione Fli-Trx di Escherichia coli già disponibile, sono stati realizzati costrutti chimerici della Flagellina di Salmonella typhi, con la Trx posta in una posizione più apicale e quindi verosimilmente più esposta. Le corrispondenti proteine di fusione verranno somministrate in animali da laboratorio in diverse formulazioni (con e senza adiuvante) per valutare l’effettiva potenzialità adiuvante della Flagellina. La presente ricerca si è inoltre posta come obiettivo secondario e futuro la valutazione di vaccini TDMI alternativi potenzialmenti autoadiuvanti, tra i quali i vaccini ‘vivi’ in ospiti batterici approvati per uso umano (e.g., Salmonella typhi) e strutture sovramolecolari ottenute utilizzando la parete di batteri lattici, non viventi e non geneticamente modificati, come sistemi di display di multiple copie dell’antigene. L’analisi della risposta immune generata negli animali vaccinati, a cui le differenti formulazioni verranno somministrate mediante metodiche alternative (orale e intranasale) all’iniezione, fornirà importanti indicazioni circa l’approccio migliore per fornire una protezione più efficace e duratura contro il virus del papilloma umano, con l’obiettivo finale di sviluppare un vaccino di seconda generazione, multivalente, auto-adiuvante e a basso costo.