Metodologie molecolari per l'analisi OGM in matrici alimentari "food and feed"

Abstract

L’evoluzione del mercato mondiale degli organismi geneticamente modificati, e di conseguenza delle normative collegate ad esso, rende necessario uno studio approfondito sulle metodiche di analisi di queste matrici. Le normative di diversi paesi rende obbligatoria la tracciabilità e l’etichettatura dei prodotti alimentari “food and feed” contenenti OGM. Il lavoro svolto in questo dottorato di ricerca si è quindi basato sullo studio delle metodologie utilizzate per l’analisi di matrici alimentari contenti OGM, tramite l’applicazione della Food Genomics, intendendo con questo termine l’applicazione degli studi sul genoma degli organismi da cui si ricavano le materie prime per stabilire l’autenticità degli alimenti. Il primo passo è stato di definire un protocollo d’estrazione del DNA per un’analisi della degradazione del materiale genetico estratto da pellet di mangime, che simulano la composizione del classico mangime ad uso zootecnico, formato da mais, soia, girasole, orzo e crusca. Questi pellet sono stati conservati a temperatura ambiente, 4°C e -20°C al fine di verificare lo stato di degradazione a diverse temperature. Le estrazioni di DNA sono state effettuate con un metodo CTAB specifico per farine, effettuando una prima estrazione a tempo T0, una seconda dopo 3 settimane, una terza dopo 6 mesi e l’ultima dopo 18 mesi. L’analisi della resa in termini di DNA estratto mostra che l’estraibilità del DNA viene mantenuta per tutte le quattro estrazioni denotando però un calo del materiale estratto con l’avanzare del tempo di conservazione, e che lo si nota soprattutto nelle condizioni di stoccaggio a temperatura ambiente. Lo stesso metodo è stato applicato per l’estrazione di DNA da prodotti commerciali per verificare la presenza di OGM. Per effettuare un altro controllo è stato utilizzato un kit commerciale d’estrazione del DNA da tessuti e apparati di pianta di mais (foglia, brattea, stocco, radici, cariosside, trinciato, ovario), come confronto con il metodo CTAB. E’ stato effettuato un confronto fra le metodiche della Food Genomics con quelle che utilizzano le proteine tramite un’analisi di farine di mais e soia con lateral flow devices. Con la soia si sono utilizzati dei lateral flow devices commerciali mentre con il mais dei lateral flow devices sviluppati nel progetto COEXTRA. Il confronto dei dati ottenuti dall’analisi proteica con una successiva analisi di PCR, ha confermato che la sensibilità delle lateral flow strip è più ridotta di quelle delle metodologie di PCR. Il passo successivo è stato di applicare al DNA estratto un analisi in PCR real-time sulle matrici precedentemente descritte, che è la metodologia d’elezione applicata nel campo della Food Genomics e dell’analisi di OGM. Nello studio della degradazione del DNA, è stata effettuata una PCR real-time con chimica TaqMan per la verifica dell’amplificazione del gene di mais endogeno zeina, che ha confermato la stabilità e l’amplificabilità del gene nelle varie condizioni analizzate. Con il DNA estratto tramite kit commerciale da vari organi della pianta di mais è stata applicata una PCR real-time duplex con i due geni endogeni zeina e alcol deidrogenasi e il costrutto transgenico Mon810. La PCR real-time duplex è risultata efficace su tutti i tessuti analizzati sia per zeina/Mon810 che per Adh/Mon810. Per il prodotto commerciale, la verifica della presenza di materiale OGM è avvenuta prima tramite analisi in PCR end-point con primer specifici per i geni endogeni zeina e lectina e per il promotore 35S, comunemente presente nei costrutti transgenici, dando origine per lotti diversi a diversi risultati di amplificazione. I campioni positivi sono stati analizzati successivamente in PCR real-time con chimica e quindi verificati in base alla Tm degli ampliconi ottenuti. Il DNA estratto è stato controllato anche con primer specifici per i costrutti transgenici EPSPS e Mon810 sempre in real-time SYBER® GreenerTM, confermando la presenza a bassi livelli di materiale transgenico.