Ruolo dei macrofagi nella patologia aterosclerotica: analisi trascrittomica delle diverse tipologie di attivazione macrofagica

Abstract

L’aterosclerosi rappresenta la principale causa di mortalità nei paesi occidentali. E’ una patologia caratterizzata da lesioni intimali che protrudono nel lume e le conseguenze più gravi sono l’infarto del miocardio, l’infarto cerebrale e ateropatia periferica. L’aterosclerosi viene considerata come una patologia infiammatoria in quanto i diversi processi che concorrono alla formazione della placca provocano una serie di risposte cellulari e molecolari che sono riconducibili a quelle infiammatorie. Lo scopo di questa tesi, è quello di studiare il profilo di espressione genica delle diverse tipologie di attivazione dei macrofagi, essendo le principali cellule coinvolte nello sviluppo dell’aterogenesi. All’interno delle arterie infatti, i macrofagi contribuiscono alla crescita della lesione e alla rottura della placca aterosclerotica, attraverso la secrezione di citochine, fattori di crescita ed enzimi proteolitici. Per tale studio abbiamo condotto esperimenti in vitro stimolando colture primarie di monociti-macrofagi con diversi tipi di citochine, sia proinfiammatorie che antinfiammatorie, generando così tre diversi fenotipi di macrofagi attivati: quello classico (M1) coinvolto nella progressione infiammatoria, quello alternativo (M2a) con caratteristiche immunoregolatore, e quello deattivato (M2c) con proprietà immunosoppressorie. Al fine di indagare il ruolo dei recettori nucleari “Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma” (PPARγ) nella differenziazione macrofagica alternativa, abbiamo analizzato l’effetto di agonisti di tali recettori sul trascrittoma di tali cellule. Il profilo di espressione genica è stato valutato su tutte le tipologie di attivaziona macrofagica utilizzando la tecnologia microarray a genoma intero, mettendo in evidenza i pattern di geni espressi nei macrofagi in base al fenotipo acquisito. I risultati sono stati validati mediante PCR quantitativa. L’analisi genomica rileva differenze trascrizionali fra le varie tipologie di attivazione macrofagica. In particolare i macrofagi M1 evidenziano una marcata attività infiammatoria e di uccisione di patogeni, mentre i macrofagi M2a risultano meno attivi nella risposta immunitaria, agendo maggiormente nella regolazione dell'infiammazione. I macrofagi M2c dal punto di vista trascrittomico assomigliano ai macrofagi residenti, suggerendo quindi un ruolo in presenza di uno stato infiammatorio. L’effetto dato dalla presenza di PPARγ agonisti conferisce alle cellule un fenotipo diverso da quello alternativo, stimolando l’attività proliferativa delle cellule e diminuendo l’espressione di geni partecipanti al processo immunitario.

Atherosclerosis is the leading cause of death in Western countries. It is a disease characterized by intimal lesions that protrude into the lumen whose consequences are myocardial infarction, cerebral infarction and peripheral artery disease. Atherosclerosis is considered an inflammatory disease, because the processes that contribute to plaque formation cause a series of cellular and molecular responses that are attributable to inflammation. The aim of the present dissertation is to study the gene expression phenotype of the different types of macrophage activation. Macrophages appear to be the main cell population involved in the development of atherogenesis since they contribute to growth and rupture of atherosclerotic plaque through the secretion of cytokines, growth factors and proteolytic enzymes. For this study we performed in vitro experiments by stimulating primary cultures of monocyte-macrophages with different cytokines, both pro and anti-inflammatory, producing three different phenotypes of activated macrophages: classical, alternative and deactivation. Classical activation (M1) was induced by IFNγ and/or LPS and displays pro-inflammatory properties; alternative activation (M2a) was originate by IL-4 and shows immuno-regulatory properties, whereas IL-10 produced a “deactivated” state, with immunosuppressing characteristics (M2c). In order to investigate the role of nuclear receptors "Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma (PPARγ) in alternative macrophage differentiation, we analyzed the effect of agonists of these receptors on the macrophage transcriptome. The gene expression profile was evaluated in all types of macrophage activation using whole genome microarray technology, highlighting the pattern of genes that resulted differentially expressed in each experimental condition. The results were validated by quantitative PCR. The transcriptional genomic analysis detected differences between the various types of macrophage activation. Trascriptomic analysis of macrophage activation confirms that M1 polarization is characterized by significant pro-inflammatory and pathogen killing activity, whereas M2a is less active in immune response, probably carrying a role in “balancing” inflammation. M2c appears to be very similar to resting macrophages, suggesting a role only in a presence of inflammatory states. PPARγ-agonist activation decreases inflammatory cytokine production and increases cell-cycle gene expression also compared to cytokine-induced M2a and M2c activation, suggesting a specific role of PPARγ in the regulation of macrophage differentiation.