Patogenesi della broncopneumopatia cronica ostruttiva: il ruolo di IL-32

Abstract

INTRODUZIONE La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) rappresenta una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo. Nel 2001 l’Organizzazione Mondiale della Sanità, infatti, ha dichiarato che la BPCO era la quinta causa di morte nei paesi ad alto reddito e la sesta in quelli a medio e basso reddito e si stima che nel 2020 la BPCO diverrà la terza causa di morte in tutto il mondo. La BPCO è definita “una malattia prevenibile e trattabile con importanti effetti extrapolmonari che, nei singoli pazienti, possono contribuire alla gravità della patologia. La sua componente polmonare è caratterizzata da una limitazione al flusso aereo non completamente reversibile, progressiva ed associata ad un’anomala risposta infiammatoria conseguente all’inalazione di particelle nocive o gas”. La BPCO è una patologia a predisposizione genetica, quindi l’esposizione a fattori di rischio estrinseci, primo tra tutti il fumo di sigaretta, non costituisce una condizione sufficiente allo sviluppo delle manifestazioni cliniche proprie della malattia, ma si deve sovrapporre ad uno stato di suscettibilità individuale. Numerosi studi hanno dimostrato che i pazienti con BPCO sviluppano una risposta infiammatoria anomala, in quanto amplificata ed in grado di automantenersi anche una volta rimosso l’agente irritante. Nella BPCO l’infiammazione cronica interessa le vie aeree centrali e periferiche, il parenchima polmonare, i vasi polmonari e si estende anche al di fuori del tessuto polmonare, coinvolgendo i linfonodi loco-regionali e la circolazione sistemica. Il processo infiammatorio è caratterizzato dall’infiltrazione tissutale da parte di linfociti T CD8+, i quali presentano un’aumentata espressione delle citochine che caratterizzano la risposta immunitaria di tipo 1, tra cui l’IFN-γ. IL-32 è una citochina di recente scoperta, la cui espressione è indotta in vitro nei linfociti T, nelle cellule natural killers, nelle cellule epiteliali polmonari e nei monociti, stimolati da citochine proinfiammatorie tipiche della risposta immunitaria di tipo 1, quali IFN-γ, IL-18, IL-1β e IL-12. Il gene che codifica per IL-32 è localizzato nel cromosoma 16p13.3 ed è formato da otto esoni, che mediante splicing alternativo, danno origine alle sei varianti note della citochina (IL-32, IL-32β, IL-32δ, IL-32γ, ε e ζ). IL-32 può indurre l’espressione di TNF-α e di altre citochine attraverso l’attivazione del fattore nucleare-κB (NF-κB) e della protein-chinasi attivata dai mitogeni p38 (MAPK-p38), dimostrando di possedere caratteristiche tipiche delle citochine proinfiammatorie. Inoltre, recenti studi in vitro ed in vivo hanno evidenziato che IL-32 potrebbe rivestire un ruolo importante nella risposta immune sia innata che acquisita. In particolare un’aumentata produzione di IL-32 è stata dimostrata nei soggetti affetti da artrite reumatoide e dal Morbo di Crohn. L’espressione di IL-32 non è mai stata indagata nella BPCO, malattia infiammatoria cronica delle vie aeree la cui patogenesi, secondo ipotesi recenti, potrebbe contemplare una componente autoimmune. Abbiamo quindi ritenuto particolarmente interessante analizzare il ruolo di questa nuova citochina nella patogenesi BPCO. OBIETTIVI Lo scopo di questa tesi è stato quello di quantificare l’espressione di IL-32 in pazienti affetti da BPCO a differenti stadi di gravità e di confrontarla con quella presente in soggetti fumatori con funzionalità respiratoria normale e in soggetti di controllo non fumatori. L’espressione di IL-32 è stata quindi correlata alla risposta infiammatoria cellulare e ai parametri clinico-funzionali caratteristici della malattia. Il ruolo di IL-32 e dell’attivazione linfocitaria è stato inoltre indagato in pazienti affetti da BPCO molto grave a patogenesi diversa, quantificando l’espressione di questa citochina ed il numero di follicoli linfoidi presenti nei polmoni nativi di soggetti sottoposti a trapiantato polmonare per enfisema in stadio avanzato con e senza deficit di alfa1-antitripsina (AAT). Inoltre, al fine di studiare l’espressione polmonare di IL-32 tramite manovre non invasive, abbiamo analizzato l’espressione di questa citochina nelle cellule dell’espettorato indotto di pazienti affetti da BPCO e l’abbiamo confrontata con quella presente in soggetti fumatori e non fumatori sani. METODI L’espressione di IL-32 è stata quantificata in campioni chirurgici polmonari prelevati da 40 soggetti con BPCO (VEMS 38±4% del teorico), 11 fumatori asintomatici con funzionalità polmonare nella norma (VEMS 101±3% del teorico) e 9 controlli non fumatori (VEMS 107±6% del teorico). Su questi campioni di tessuto è stata eseguita l’analisi morfometrica al fine di quantificare la produzione di IL-32 e di TNF-α nei macrofagi alveolari, nelle pareti alveolari, nei bronchioli e nelle arteriole. L’espressione di IL-32 è stata inoltre correlata al livello di fosforilazione di p38 MAPK, al numero di neutrofili e di linfociti T CD8+ infiltranti le pareti alveolari e al grado di ostruzione delle vie aeree. L’espressione di IL-32 è stata poi valutata in campioni chirurgici polmonari ottenuti da 10 soggetti affetti da BPCO molto grave (GOLD IV) con deficit di AAT (VEMS 19±2% del teorico), 12 soggetti con BPCO molto grave (GOLD IV) e normali livelli di AAT (VEMS 18±2% del teorico), 11 fumatori di controllo (VEMS 102±3% del teorico) e 9 non fumatori di controllo, asintomatici e con funzionalità respiratoria nella norma (VEMS 108±6% del teorico). IL-32 è stata quantificata a livello dei macrofagi alveolari, delle cellule dei setti alveolari e dei follicoli linfoidi del parenchima polmonare. Inoltre abbiamo quantificato il numero e la distribuzione dei follicoli linfoidi nei polmoni nativi di 9 soggetti affetti da BPCO molto grave (GOLD IV) con deficit di AAT (VEMS 19±2% del teorico) e 27 soggetti con BPCO molto grave e livelli normali di AAT (VEMS 20±2% del teorico), sottoposti a trapiantato polmonare per enfisema in stadio avanzato. Infine, per studiare l’espressione di IL-32 a livello polmonare tramite metodiche non invasive, abbiamo quantificando l’espressione di questa citochina nelle cellule dell’espettorato indotto di 19 pazienti affetti da BPCO e l’abbiamo confrontata con quella presente in 17 soggetti fumatori e 12 non fumatori con funzionalità polmonare nella norma. RISULTATI Nei macrofagi alveolari, nelle pareti alveolari e nell’epitelio bronchiolare l’espressione di IL-32 era aumentata in modo significativo nei fumatori con BPCO rispetto ai soggetti di controllo fumatori e non fumatori (p=0.0014 e p<0.0001). L’espressione di TNF-α era significativamente aumentata nei soggetti affetti da BPCO rispetto ai controlli non fumatori sia nei macrofagi alveolari (p<0.0001) che nelle pareti alveolari (p<0.018). Inoltre l’espressione di IL-32 correlava positivamente con l’espressione di TNF-α (p<0.0001, r=0.7), con il numero di cellule CD8+ (p=0.006, r=0.46) e con il livello di fosforilazione della p38 MAPK (p=0.005, r=0.51), e negativamente con i valori di VEMS (p<0.0001, r=-0.53). Per quanto riguarda la quantificazione di IL-32 in soggetti affetti da BPCO molto grave, nessuna differenza significativa è stata evidenziata nell’espressione di questa citochina tra i soggetti con deficit di AAT e quelli con livelli normali di questa antiproteasi. In particolare l’espressione di IL-32 nei macrofagi alveolari e nelle pareti alveolari era significativamente aumentata nei soggetti con BPCO sia con deficit di AAT che in quelli con livelli normali di AAT, rispetto ai fumatori con funzionalità polmonare nella norma e ai controlli non fumatori (p<0.005 per ogni confronto). Nei follicoli linfoidi l’espressione di IL-32 era significativamente aumentata nei soggetti con BPCO e livelli normali di AAT rispetto ai fumatori e ai non fumatori di controllo (p<0.05 per ogni confronto). Un trend simile è stato osservato per i pazienti con deficit di AAT (p<0.06 per ogni confronto). La quantificazione dei follicoli linfoidi parenchimali nei soggetti affetti da BPCO molto grave ha dimostrato che il numero totale di follicoli era aumentato nei soggetti con deficit di AAT, rispetto ai soggetti con livelli di AAT nella norma (p=0.0002). Infine l’espressione di IL-32 è stata osservata a livello delle cellule macrofagiche dell’espettorato indotto, soprattutto a livello citoplasmatico. Tale espressione è risultata elevata sia nei soggetti affetti da BPCO che nei soggetti fumatori e non fumatori sani, senza differenze significative tra i tre gruppi di soggetti esaminati. CONCLUSIONI In conclusione, il nostro lavoro ha dimostrato un importante aumento dell’espressione di IL-32 nel polmone periferico dei pazienti affetti da BPCO rispetto ai soggetti di controllo fumatori e non fumatori. Inoltre l’espressione di IL-32 è risultata aumentata sia nei pazienti affetti da BPCO molto grave con livelli di AAT nella norma che in quelli con deficit di AAT. Questi risultati suggeriscono che IL-32 possa avere un ruolo importante nella persistenza della risposta infiammatoria, contribuendo alle alterazioni anatomopatologiche tipiche della BPCO. Nei pazienti con deficit di AAT i meccanismi patogenetici sembrano inoltre coinvolgere un’importante risposta immunitaria, in cui l’espressione di IL-32 e l’attivazione linfocitaria potrebbero contribuire alla perpetuazione del danno polmonare. I nostri dati suggeriscono infine che l’analisi dell’espettorato indotto, quale metodica non invasiva, potrebbe non riflettere accuratamente i meccanismi patogenetici presenti nel polmone profondo. Le cellule a livello delle vie aeree centrali infatti potrebbero essere soggette ad una stimolazione infiammatoria diversa rispetto alle cellule del parenchima polmonare.

BACKGROUND Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a leading cause of morbidity and mortality in countries of high, middle, and low income. Estimates from WHO's Global Burden of Disease show that in 2001, COPD was the fifth leading cause of death in high-income countries and the sixth in nations of low and middle income. The working definition of COPD is “a preventable and treatable disease with some significant extrapulmonary effects that may contribute to the severity in individual patients. Its pulmonary component is characterized by airflow limitation that is not fully reversible. The airflow limitation is usually progressive and associated with an abnormal inflammatory response of the lungs to noxious particles or gases”. COPD is a classic gene-by-environment disease with various manifestations that reflect both the individual susceptibility and the degree of exposure to irritants, of which cigarette smoking is the most frequent. A number of studies in the past have demonstrated that, in patients with COPD, a chronic inflammation is present throughout the airways, lung parenchyma and pulmonary vasculature and extends even outside the lung, involving lymph nodal stations and the systemic circulation. This inflammatory response is characterized by tissue infiltration of CD 8+ T lymphocytes, which are shifted toward a type 1 profile with production of IFN-γ among other cytokines. Interleukin (IL)-32 is a recently described cytokine produced by T lymphocytes, natural killer (NK) cells, monocytes and epithelial cell lines. Of particular importance, IL-32 is prominently induced by interferon (IFN)-γ in lung epithelial cells and monocytes in vitro. The gene encoding IL-32, which is organized into eight exons, is located on human chromosome 16p13.3 and may be transcribed in six splice variants (IL-32, IL-32β, IL-32δ, IL-32γ, ε and ζ). IL-32 exhibits several properties typical of proinflammatory cytokines. For example, it has been described as an inducer of TNF-α and many other cytokines through the activation of nuclear factor-κB (NF-κB) and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK). IL-32 has recently emerged as an important player in innate and adaptive immune responses in vitro. In humans, there are only two in vivo studies which have demonstrated upregulation of IL-32, one in rheumatoid arthritis and the other in Crohn’s disease. Whether IL-32 is also implicated in the pathogenesis of COPD still remains to be investigated. AIM The aim of this study was to quantify the expression of IL-32 in the lung tissue of COPD patients at different stages of severity. Moreover, we compared it with the production of IL-32 in smokers with normal lung function and in non-smoking controls. Indeed, the expression of IL-32 was correlated with the cellular inflammatory infiltration and with the spirometrical parameters that characterize the disease. The role of IL-32 and lymphocyte activation was also investigated in very severe COPD patients with different pathogenesis. We quantified the expression of IL-32 and the lymphoid follicle number in the native lung parenchyma of COPD subjects undergoing lung transplantation for end-stage emphysema with and without alpha1-antitrypsin (AAT) deficiency. Moreover to study the expression of IL-32 in the lung using non invasive tools, we analyzed the expression of this cytokine in the induced sputum of COPD patients and we compared these results with those obtained from control smokers and non-smokers. METHODS The expression of IL-32 was quantified in surgically resected specimens from 40 smokers with COPD (FEV1 38±4% pred), 11 asymptomatic smokers with normal lung function (FEV1 101±3% pred) and 9 non-smoking controls (FEV1 107±6% pred). In fact, in these lung specimens we performed morphometric analysis to quantify IL-32 and TNF-α in alveolar macrophages, alveolar walls, bronchioles and arterioles. Moreover, the expression of IL-32 was correlated with phosphorylation of p38 MAPK, with the number of neutrophils and CD8+ T cells infiltrating the alveolar walls, and with the degree of airway obstruction. The expression of IL-32 was also analyzed in surgical lung samples from 10 very severe COPD (GOLD IV) with AAT deficiency (FEV1 19±2% pred), 12 very severe COPD (GOLD IV) with normal levels of AAT (FEV1 18±2% pred), 11 asymptomatic smokers with normal lung function (FEV1 102±3% pred) and 9 non-smoking controls (FEV1 108±6% pred). We quantified IL-32 expression in alveolar macrophages, alveolar walls and parenchymal lymphoid follicles. Moreover, we numbered and characterized the distribution of lymphoid follicles in the native lungs of 9 very severe COPD (GOLD IV) with AAT deficiency (FEV1 19±2% pred) and 27 very severe COPD (GOLD IV) with normal levels of AAT (FEV1 20±2% pred) undergoing lung transplantation for end-stage emphysema. Finally to study IL-32 expression in the lung using non invasive methods, we analyzed the expression of this cytokine in the sputum cells of 19 COPD patients and we compared these results with those obtained from 17 control smokers and 12 control non-smokers. RESULTS IL-32+ macrophages were increased in smokers with COPD compared to control smokers and non-smokers (p=0.0014 and p<0.0001). A similar pattern was observed even in alveolar walls and bronchiolar epithelium. TNF-α expression was increased in smokers with COPD as compared to non-smokers both in alveolar macrophages (p<0.0001) and alveolar walls (p=0.018). Moreover, IL-32 expression was positively correlated with TNF-α (p<0.0001, r=0.7), CD8+ cells (p=0.006, r=0.46) and phospho p38 MAPK (p=0.005, r=0.51), and negatively with FEV1 values (p<0.0001, r=-0.53). IL-32 expression was similar in very severe COPD patients with and without AAT deficiency. In particular IL-32+ macrophages and IL-32+ alveolar wall cells were increased in these two COPD patient groups compared to smokers and non-smokers with normal lung function (p<0.005 for all). IL-32 expression was increased in lymphoid follicles with COPD and normal levels of AAT compared to smoker and non-smokers controls (p<0.05 for all). A similar trend was observed for COPD patients with AAT deficiency (p<0.06 for all). The quantification of lymphoid follicles showed that these were a frequent occurrence in subjects with severe emphysema both with and without AAT deficiency. In particular the total number of lymphoid follicles was increased in patients with AAT deficiency as compared to subjects with normal levels of AAT and this was mainly due to a higher number of parenchymal lymphoid follicles (p=0.0002). Finally, IL-32 expression was observed in the macrophages of induced sputum, particularly in the cytoplasm. This expression was high not only in COPD subjects but also in smoker and non-smoker controls. CONCLUSIONS This study demonstrates, for the first time, upregulation of IL-32 in the peripheral lung of COPD patients that was correlated with the production of TNF-α and with the degree of airway obstruction. IL-32 expression was also increased in peripheral lung of very severe COPD either with AAT deficiency or without AAT deficiency. From these results we can gather that IL-32 may play a role in the persistence of the immune response leading to tissue damage in COPD. Moreover, in AAT deficient patients as well the pathogenetic mechanisms seem to involve an important immune response characterized by IL-32 expression and lymphoid activation leading to perpetuated lung damage. Finally, we conclude that induced sputum analysis may not accurately reflect the pathogenetic mechanisms of peripheral lung. In fact, cells in the central airways could be stimulated by an inflammatory process different from that present in the lung parenchyma.