Regolazione epigenetica dell'espressione di clusterina in linee cellulari umane di cancro prostatico

Abstract

La Clusterina (CLU) è un proteina ubiquitaria, presente nella maggior parte dei fluidi biologici, che è implicata in quasi tutti i processi fisiologici fondamentali dell’organismo umano e nello sviluppo di diverse malattie come il cancro e l’Alzheimer. Il gene umano CLU è costituito da 9 esoni e si colloca nella regione centrale del braccio corto del cromosoma 8 (8p21-p12), zona frequentemente deleta nel cancro della prostata. Un recente aggiornamento in GenBank ha evidenziato l’esistenza di due varianti trascrizionali della CLU umana (NM_001831 Isoforma 1; NM_203339.1 Isoforma 2), presenti esclusivamente nei primati, lche hanno sostituito la precedente sequenza M64722.1. Queste isoforme condividono la sequenza nucleotidica dall’esone 2 all’esone 9 e la regione 3’ non tradotta, ma possiedono un esone 1 diverso e specifico. Inoltre nel 2003 è stato descritto un ulteriore messaggero nel quale, in seguito ad un fenomeno di splicing alternativo, parte dell’esone 1 di quella che attualmente è Isoforma 1 sarebbe direttamente legato all’esone 3. Attualmente in letteratura sono descritte differenti forme proteiche di Clusterina caratterizzate da funzioni e localizzazioni cellulari differenti: la forma presecretoria (psCLU), la forma secreta (sCLU), la forma nucleare (nCLU). La traduzione a partire dall’AUG nell'esone 2, presente in entrambe le isoforme, genera un precursore citoplasmatico di circa 60 kDa (psCLU) che una volta processato porta alla produzione della proteina matura destinata alla secrezione s(CLU). sCLU si presenta come un eterodimero aβ glicosilato di circa 75-80 kDa e si comporta come un chaperone molecolare ATP indipendente. La traduzione a partire dal codone d’inizio presente nel terzo esone, anch’esso comune ed entrambe le isoforme, genera invece una forma a localizzazione nucleare (nCLU o forma troncata) con funzione proapoptotica del peso di 45-50 kDa. Ad oggi deve essere fatta ancora chiarezza sul processo che porta a partire da un unico gene alla trascrizione dei due differenti messaggeri e alla sintesi delle tre varianti proteiche. Inoltre, scarsi sono i dati sul loro possibile meccanismo specifico di azione. In questo lavoro di tesi è stata valutata la distribuzione delle due isoforme di CLU e la presenza del messagero alternativo proposto nel 2003 in diverse linee cellulari umane. Questa analisi non ha confermato eventi di splicing alternativo ma ha evidenziato una differente espressione delle due varianti trascrizionali di CLU: L’Isoforma 1 è costitutivamente espressa in tutte le linee analizzate, mentre l’Isoforma 2 risulta assente in tutte le linee tumorali prese in considerazione, apparendo quindi correlata in modo specifico agli eventi coinvolti nella trasformazione neoplastica. I dati emersi da questa primo studio ci hanno portato ad ipotizzare una regolazione differenziale dell’espressione di questi due trascritti che potrebbe derivare dalla presenza di regioni promotrici e di siti d’inizio trascrizione (TSS) differenti. Questa ipotesi coinvolgerebbe meccanismi di tipo epigenetico. Un’analisi “in silico” della regione genomica di CLU ha effettivamente rilevato la presenza di TSS e regioni promotrici differenti per le due isoforme ed ha inoltre individuato due isole CpG, potenzialmente oggetto di metilazione. In letteratura, sono riportati diversi lavori che propongono una regolazione di CLU per via epigenetica ma in nessuno di questi è stato preso in considerazione come questa possa eventualmente influire in modo differenziale sulla trascrizione delle due isoforme. Perciò si è proceduto trattando le linee cellulari di cancro prostatico PC3 e DU145 con tricostatina A (TSA), un inibitore delle istone deacetilasi (HDAC) di classe I e II e/o con 5-aza-2’deossicitidina (5AzadC), un inibitore delle DNA metiltransferasi (DNMT), al fine di valutare gli effetti da essi indotti sull’espressione di CLU. È così emerso che tali composti sono in grado di indurre in cellule tumorali prostatiche un rimodellamento della cromatina a livello delle regione promotrici di CLU che comporta: i) la riattivazione della trascrizione dell’Isoforma 2; ii) un incremento nella produzione e nella secrezione di sCLU; ii) la comparsa in DU145 di nCLU, che si localizza a livello nucleare inducendo queste cellule ad intraprendere il pathway di morte programmata per apoptosi. Nel complesso, i dati raccolti evidenziano che è presente una down-regolazione dell’espressione di CLU in cellule tumorali di prostata, particolarmente marcata a livello della trascrizione dell’Isoforma 2, che quale appare completamente repressa. I risultati ottenuti, visti nel loro insieme, portano ad ipotizzare che alla base di questo tipo di silenziamento genico vi siano meccanismi di regolazione epigenetica differenziali che agiscono probabilmente a livello di regioni genomiche diverse.