Synthesis of cysteine-reactive compounds as drugs or pharmacological tools

Abstract

L’impiego di molecole reattive nei processi di drug discovey è spesso scoraggiato a causa della loro potenziale tossicità od instabilità metabolica. Infatti, se non adeguatamente indirizzata verso il bersaglio desiderato, la loro reattività nei confronti di bersagli biologici alternativi o rispetto a nucleofili biologici come il glutatione (GSH) potrebbe tradursi in effetti tossici indesiderati. D'altra parte, composti reattivi in grado di legare selettivamente i loro recettori con interazioni covalenti potrebbero essere utili per il trattamento di molte malattie clinicamente rilevanti, nonché per lo sviluppo di nuovi strumenti per l’indagine biologica o farmacologica. All’interno di questa classe di sostanze, i composti in grado di legare covalentemente i gruppi tiolici cisteinici rappresentano una delle classi più promettenti per lo sviluppo di composti farmacologicamente sfruttabili. La reattività specifica di questi composti nei confronti dei gruppi sulfidrilici fornisce loro la capacità di legare selettivamente i residui cisteinici esposti dal bersaglio designato limitando, nel contempo, la loro interazione con altri nucleofili presenti nell'ambiente biologico. Considerando che la cisteina è scarsamente espressa nella struttura primaria di molte proteine rispetto ad altri aminoacidi strutturali, solo un limitato sottoinsieme di bersagli biologici dovrebbe presentare residui cisteinici esposti al solvente disponibili ad essere legati da questa classe di composti. Inoltre, dal momento che è raro rilevare proteine non correlate che condividano uno stesso pattern di esposizione di residui cisteinici dopo il processo di folding, il microambiente esistente intorno ai residui cisteinici esposti può essere sfruttato per sviluppare composti covalenti ad alta specificità, in grado di discriminare target biologici differenti fra le proteine esprimenti residui cisteinici accessibili. In questo modo, i composti sviluppati potrebbero essere utilizzati come “tagging agents” ad alta specificità nel contesto della sperimentazione biologica ma anche, successivamente ad un incremento della loro stabilità metabolica e/o della loro specificità di azione ottenuto attraverso opportune ottimizzazioni strutturali, come farmaci. Farmaci cisteino-reattivi già in commercio quali la Fosfomicina (Monouril ®), l’Omeprazolo (Antra ®) ed il Disulfiran (Antabuse ®), così come molti altri composti in fase di sperimentazione, rappresentano ottimi esempi di come composti in grado di legare covalentemente residui cisteina possano essere sfruttati a livello farmacologico. Durante lo svolgimento di questo progetto di Dottorato di Ricerca sono stati progettati e sintetizzati nuovi inibitori covalenti ad attività cysteine-trap per il dominio Tyrosin Kinasico dell’Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR-TK) e per l’enzima MonoAcylGlyceorol Lypase (MAGL). Entrambi questi enzimi presentano residui di cisteina esposti al solvente adatti ad essere legati da composti ad attività cystene-trap opportunamente progettati. L’interazione covalente di questi composti con i loro relativi bersagli porta alla formazione di complessi farmaco-enzima sufficientemente stabili da produrre un binding irreversibile, o per lo meno di lunga durata, dei residui cisteinici bersaglio e quindi in grado di assicurare un’elevata occupazione recettoriale. Il binding covalente di EGFR-TK risulta essere utile per il trattamento di forme di cancro in cui l'espressione di una forma mutata di EGFR (T790M) è in grado di conferire farmaco-resistenza nei confronti dei convenzionali inibitori non covalenti di EGFR. In questi casi, il legame covalente con il residuo cisteinico Cys773 presente all’interno del sito attivo di EGFR-TK comporta un’incrementata affinità di legame per il target, garantisce un’elevato livello di occupazione recettoriale e consente di superare il fenomeno della farmaco-resistenza. L’aumento di affinità indotto dall’instaurarsi dell’interazione covalente fra questi composti ed un dato bersaglio biologico può anche essere considerata come un buon punto di partenza per la messa a punto di studi SAR finalizzati all’ottimizzazione strutturale dei composti considerati. In questo senso, infatti, la manipolazione strutturale di composti ad attività covalente può essere effettuata con un diminuito rischio di perdere affinità per il bersaglio designato. Questo concetto è stato applicato alla progettazione di nuovi inibitori cysteine-trap per MAGL. In questo caso, i composti sintetizzati sono stati progettati per presentare livelli elevati di diversità strutturale al fine di ottimizzare il loro fitting recettoriale. Tutti i composti sintetizzati nell’ambito di questio progetto di Dottorato presentano una porzione cisteino-reattiva (warhead) di struttura variabile legata a diversi motivi strutturali non reattivi (driver groups) progettati per modulare il receptor fitting. L’inibizione di EGFR-TK mediante composti ad attività cysteine-trap è stata portata a termine utilizzando composti caratterizzati da un driver group di tipo 6-amino-4-(3-bromoanilino)chinazolinico collegato ad una piccola collezione di warheads, selezionate in modo da possedere un ampio spettro di meccanismi di interazione covalente. Per i composti sintetizzati è stata valutata la capacità di inibire il processo autofosforillativo di attivazione di EGFR come anche di inibire la proliferazione di popolazioni cellulari tumorali overesprimenti EGFR. Inoltre, al fine di valutare il loro potenziale terapeutico nei riguardi di tumori resistenti ai convenzionali inibitori non covalenti di EGFR, è stata indagata la loro efficacia nell’inibire la proliferazione cellulare in cellule tumorali esprimenti EGFR T790M. L’inibizione di MAGL mediante composti ad attività cysteine-trap cisteina è stata ottenuta variando sia le warheads sia i driver groups caratterizzanti i composti utilizzati. Dal momento che per tale scopo si sono utilizzate solamente tre tipologie di warhead eterocicliche, la variabilità dei gruppi cisteino-reattivi in questo studio SAR può essere considerata modesta. Al contrario, al fine di esplorare l’intorno farmacoforico dei residui cisteinici bersaglio, la porzione driver è stata oggetto di una più ampia manipolazione strutturale. L’elevata potenza inibitoria fornita dai composti sintetizzati relativamente a EGFR-TK e MAGL è incoraggiante e dimostra come composti ad attività cysteine-trap possano essere efficacemente utilizzati nell’ambito dei processi di drug discovery. Inoltre, i bassi profili di citotossicità rilevati unitamente all'efficacia dimostrata di alcuni inibitori di EGFR-TK nell’inibire la proliferazione cellulare su linee tumorali resistenti mostra come tipi di warhead differenti possano essere impiegate per lo sviluppo di nuovi inibitori irreversibili di EGFR capaci di superare la farmaco-resistenza indotta dell’espressione di EGFR T790M con un migliorato rapporto di efficacia/tossicità.

The use of reactive molecules in drug discovery is often discouraged because of their potential toxicity or metabolic instability. Indeed, if not properly driven to the desired target, their reactivity toward biological nucleophiles like glutathione (GSH) or unwanted biological target could result in unfavourable toxicological outcomes. On the other hand, reactive agents able to selectively bind their receptors with covalent interactions could be beneficial for the treatment of many clinically relevant diseases as well as for the development of new tools for biological or pharmacological investigation. Among covalent reactive compounds, cysteine trapping compounds are one of the most pharmacologically exploitable classes of substances able to bind their target by establishing a covalent interaction. Their specific reactivity toward thiols provides them the ability to selectively bind cysteine exposing target without covalently interacting with other nucleophiles presents in the biological environment. Considering that cysteine has a low expression level in proteins with respect of other structural aminoacids, only a limited subset of biological targets should present solvent exposed cysteine suitable to be bound by cysteine trapping agents. Moreover, since it is uncommon to find unrelated folded proteins with a similar cysteine exposure pattern, the microenvironment around cysteine residues can be exploited to develop specific cysteine trapping agents able to discriminate different targets among cysteine exposing proteins. In this way, cysteine trapping agents could be used as specific labelling agents in biological investigations or, once their metabolic stability and target specificity are increased by proper structural optimizations, as drugs. Commercial cysteine reactive drugs like fosfomycin (Monouril ®), omeprazole (Antra ®) or disulfiram (Antabuse ®), as well as many other drug candidates, are good examples of the pharmacological exploitability of this kind of covalent modifier. New specific cysteine reactive covalent inhibitors for Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase domain (EGFR-TK) and for MonoAcylGlyceorol Lypase enzyme (MAGL) were designed and synthesized during this accomplishment of this PhD project. Both of these enzymes present solvent exposed cysteine residues suitable for binding with properly designed thiol reactive compounds. The resulting covalently strengthened drug-enzyme complexes are often stable enough to provide long-lasting or irreversible binding of the targeted cysteine and to assure high receptor occupancy. The irreversible binding of EGFR-TK is beneficial for the treatment of cancer in which the expression of a mutated form of EGFR (T790M) induces drug resistance toward conventional non-covalent drugs. In this case, the covalent binding of Cys773 on EGFR-TK provides an increased binding affinity for the target, assures high level of EGFR-TK occupancy and overcomes the drug resistance. The increased target affinity provided by the covalent binding mode can also represents a good starting point to set-up SAR studies focused on the structural optimization of selected ligands. Indeed, the structural manipulation of a covalent binder can be carried out with a decreased risk of binding affinity loss. This concept was applied to the design of new cysteine trapper MAGL inhibitors. In this case, the synthesized compounds were designed to present high structural diversity levels in order to optimize their receptor fitting. All synthesized compounds within this PhD project present a variable cysteine reactive portion (warhead) linked to different non-reactive structural motives (driver group) designed to modulate the receptor fitting. EGFR-TK cysteine targeting was achieved using a well-known 6-amino-4-(3-bromoanilino)quinazoline driver group linked to a small panel of warheads based on a wide spectrum of cysteine trapping mechanisms. In this case, the ability of the synthesized compounds to inhibit the auto-phosphorylative EGFR activation process as well as to inhibit the proliferation of EGFR overexpressing cells was evaluated. Moreover, their effectiveness to hamper the proliferation of cells expressing EGFR T790M was evaluated too, in order to evaluate their therapeutic potential on drug resistant tumour cells. MAGL cysteine targeting was achieved varying both warheads as well as driver portions. Because only three kinds of heterocyclic cysteine reactive portions were used as warhead portions, the warhead diversity was maintained low in this SAR study. On the other hand, a wider structural manipulation of the driver portion was carried out to explore the pharmacophoric space around the targeted cysteine. The high inhibition potency achieved by synthesized compounds on EGFR-TK and MAGL is encouraging and shows how much cysteine trapping agents could be useful in drug discovery processes. Moreover, the low cytotoxicity profiles and the effectiveness of some synthesized EGFR-TK inhibitors to hamper the proliferation of cell harbouring T790M EGFR shows that different kinds of cysteine reactive warheads could be used to develop new EGFR irreversible inhibitors able to overcome the drug resistance in tumours with enhanced efficacy/toxicity ratio.