Aspetti funzionali della compartimentalizzazione nucleare di proteine di citomegalovirus umano in un modello di infezione litica in vitro

Abstract

Il nucleolo è un dominio nucleare coinvolto nella biogenesi dei ribosomi, così come in molte importanti attività regolatorie cellulari, tra cui il controllo del ciclo cellulare e i processi di maturazione e trasporto di mRNA. Inoltre, numerosi dati di letteratura descrivono un coinvolgimento del compartimento nucleolare durante il ciclo replicativo di molti agenti virali, tra cui i virus erpetici. Precedenti studi svolti dal nostro gruppo di ricerca su citomegalovirus umano (HCMV), hanno dimostrato l’accumulo preferenziale a livello nucleolare (in particolare, anche a livello della matrice nucleolare) di una delle maggiori fosfoproteine (pp65) del tegumento virale nel modello sperimentale costituito da fibroblasti umani infettati liticamente; tale effetto era già evidente a tempi molto precoci dopo l’infezione. Il progetto di ricerca sviluppato e descritto in questa tesi sperimentale è stato rivolto alla valutazione delle possibili implicazioni funzionali (con particolare riferimento all’espletamento del programma di espressione litica virale) della localizzazione nucleolare della proteina pp65 di HCMV. Uno degli strumenti inizialmente impiegati per tale verifica è stato l’utilizzo di sostanze, quali actinomicina D e cisplatino, di cui è nota, qualora utilizzate a basse concentrazioni, una selettiva azione inibitoria sull’enzima RNA polimerasi I (lasciando invece inalterata l’attività di RNA polimerasi II e III) e, conseguentemente, sulla sintesi di RNA ribosomiale. In tali condizioni sperimentali è stata osservata una significativa ridistribuzione delle proteine nucleolari dal nucleolo al nucleoplasma ed una simultanea deplezione della proteina virale pp65 dal compartimento nucleolare; questo effetto era altamente evidente sia in monostrati di fibroblasti trattati per l’estrazione della matrice nucleare in situ, sia in cellule non trattate. In concomitanza a tali effetti, relativi alla deplezione nucleolare di pp65 ed all’inibizione dell’attività dell’enzima RNA polimerasi I, è stata di significativo interesse l’osservazione di un netto ritardo nell’avvio del programma litico di espressione genica virale. Questi risultati suggeriscono una possibile relazione tra la localizzazione nucleolare di pp65, la sintesi di rRNA, e la regolazione dell’ espressione genica di HCMV. Tra le funzioni nucleolari di possibile interesse per HCMV ed eventualmente legate anche alla sintesi di rRNA, l’attenzione si è concentrata sul ciclo cellulare, la cui regolazione avviene anche a livello nucleolare e la cui modulazione da parte di HCMV è nota in diversi modelli sperimentali. I dati ricavati dallo studio di questo importante aspetto supportano l’ipotesi di un ruolo potenzialmente rilevante di pp65, e della sua localizzazione nucleolare, nel controllo del ciclo cellulare da parte di HCMV (in grado di arrestare la proliferazione del modello cellulare utilizzato in fase G1-G1/S), e nel corretto avvio del programma litico virale. In particolare, i risultati ottenuti dimostrano che, sebbene l’ingresso del virus nella cellula ospite non sia influenzato dalla fase metabolica in cui questa si trova, la localizzazione dell’antigene virale pp65 a livello del nucleolo è significativamente maggiore in cellule in fase G1 e G1/S, rispetto a quelle che si trovano in S o in G2/M. In concomitanza, è stato osservato che solo cellule in fase G1 o G1/S sono in grado di sostenere una corretta ed efficiente realizzazione del ciclo litico di HCMV, che risulta, invece, fortemente penalizzato in S e in G2/M. Tali osservazioni avvalorano ulteriormente l’ipotesi di un possibile coinvolgimento di pp65 nei processi di regolazione e signaling correlati a funzioni nucleolari, come il controllo del ciclo cellulare. Al fine di individuare possibili partners molecolari con cui interagirebbe la proteina virale pp65 a livello del nucleolo, l’attenzione è stata rivolta allo studio di antigeni nucleolari di rilevanza nell’ambito del controllo del ciclo cellulare (oltre che della sintesi di rRNA), come nucleolina (C23), nucleofosmina, fibrillarina e UBF (“Upstream Binding Factor”). Esperimenti di microscopia confocale e di coimmunoprecipitazione reciproca, hanno indicato C23 quale uno dei possibili partners molecolari di pp65 a livello nucleolare. Questa ipotesi è stata ulteriormente supportata da esperimenti di silenziamento genico di C23. Sebbene si tratti di dati preliminari, tuttavia essi sembrano confermare un chiaro coinvolgimento di tale proteina nucleolare nell’interazione con la proteina pp65 di HCMV; infatti, in fibroblasti in cui era stato realizzato il silenziamento genico di C23, non si assisteva più alla localizzazione nucleolare di pp65. Inoltre, l’espressione delle proteine precocissime maggiori di HCMV era significativamente inibita, non solo come efficienza, ma anche relativamente alla loro dislocazione cellulare, con assenza di accumulo nucleare e presenza delle stesse a livello citoplasmatico.

SUMMARY The nucleolus is a nuclear domain involved in the biogenesis of ribosomes, as well as in many other important cellular regulatory activities, such as cell cycle control and mRNA transport and processing. Several literature data describe the involvement of the nucleolar compartment during the replication cycle of many viruses, including herpesviruses. In a previous study, we demonstrated the preferential targeting and accumulation of one of the major human cytomegalovirus (HCMV) tegument phosphoprotein (pp65) to the nucleolar compartment and, in particular, to the nucleolar matrix of lytically infected fibroblasts; such targeting was already evident at very early times after infection. The aim of the present study was to investigate the functional significance of HCMV pp65 targeting to the nucleolar compartment (particularly related to the HCMV gene expression over the course of the lytic program). First of all, we assessed the possible effects of rRNA synthesis inhibition on the development of HCMV lytic infection, by using either actinomycin D or cisplatin at low concentrations, that are known to selectively inhibit RNA polymerase I activity, and hence ribosome biogenesis, whilst leaving RNA polymerase II and III functions unaffected. Upon inhibition of rRNA synthesis by either agent, we observed a significant redistribution of nucleolar proteins within the nucleoplasm and a simultaneous depletion of viral pp65 from the nucleolus; this effect was highly evident in both unextracted cells and in nuclear matrices in situ. Of particular interest, even a brief suppression of rRNA synthesis resulted in a very strong inhibition of the progression of HCMV infection, as was concluded from the absence of accumulation of HCMV major immediate-early proteins within the nucleus of infected cells. These data suggest that a functional relationship might exist between rRNA synthesis, pp65 localization to the nucleolus and the normal development of HCMV lytic infection. Among nucleolar functions of potential interest for HCMV, and related to rRNA synthesis, we focused on cell cycle control, that occurs also in the nucleolus and which is modulated by HCMV. The original data arisen from the present study support the hypothesis of a potentially relevant role of pp65, and its nucleolar localization, in the control of the cell cycle by HCMV (that is known to induce a blockade of cell proliferation in G1–G1/S in many experimental models), and for the development of viral infection. Specifically, in this study we demonstrate that, although the incoming pp65 amount in the infected cells appears to be constant irrespective of the cell-cycle phases, its nucleolar accumulation is prominent in G1 and G1/S, but very poor in S or G2/M. This correlates with the observation that only cells in G1 and G1/S supported an efficient development of the HCMV lytic cycle, in contrast with S and G2/M phases, where infection was highly reduced. These data reinforce the hypothesis of HCMV pp65 involvement in regulatory/signaling pathways related to nucleolar functions, such as the cell-cycle control. In order to detect possible molecular partners of pp65 in the nucleolar compartment, we focused our attention on the relationship between this viral antigen and nucleolar proteins of interest in cell cycle and rRNA synthesis control, such as nucleolin (C23), nucleophosmin, fibrillarin and UBF (Upstream Binding factor). Confocal microscopy analysis and reciprocal co-immunoprecipitation point to C23 as a possible pp65 partner in the nucleolus. Accordingly, by preliminary experiments of C23 knockdown, pp65 was no longer found in the nucleolus of infected cells; moreover, in these experimental conditions we observed not only a significantly reduced expression of HCMV major immediate-early proteins, but also a lack of their nuclear accumulation and a poor presence in the cytoplasmic compartment.