Caratterizzazione molecolare e correlazioni clinico-patologiche di epatocarcinomi

Abstract

Le basi molecolari dell’epatocarcinoma sono complesse e determinate dall’interazione di fattori ambientali e genetici specifici per ogni singolo paziente, caratterizzando ogni tumore come un’entità clinico-patologico-genetica unica e complessa. Distinti sottotipi di HCC sono stati definiti attraverso l’integrazione di parametri clinico-patologici, analisi di mutazione e gene profiling. È stato recentemente dimostrato come HCC con attivazione del pathway Wnt mostrino una distinta morfologia e migliore sopravvivenza. Tali HCC sono inoltre caratterizzati da mutazioni e/o immunoreattività nucleare di β-catenina (CTNNB1), da iperespressione di glutamina sintetasi (GS) ed associati a specifici profili di espressione genica. Nel presente lavoro sono state valutate le correlazioni clinico-patologiche e molecolari di una serie di epatocarcinomi caratterizzati da attivazione del pathway di segnale Wnt. Resezioni chirurgiche di 84 epatocarcinomi provenienti da 77 pazienti sono state indagate per espressione immunoistochimica di CTNNB1 e GS, analisi mutazionale del gene CTNNB1 e la presenza di perdite alleliche nei bracci cromosomici 1p, 8p, 16p, 17p e 19q utilizzando un pannello di diciotto markers microsatellitari. L’analisi di perdita allelica (LOH) è stata condotta sia in noduli di HCC a stadio neoplastico avanzato sia in più componenti di una stessa neoplasia a diverso grado di progressione. L’immunoreattività del tessuto tumorale per GS e/o CTNNB1 ha reso possibile la suddivisione dei pazienti in due gruppi; 56 casi (GS+) e 28 controlli (GS-). HCC GS+ sono risultati significativamente caratterizzati da un eziologia di tipo virale (p=0.05), dimensioni dei noduli (>3cm) (p=0.05), pattern di crescita di tipo espansivo (0.003), presenza di capsula peritumorale (p>0.001). L’ulteriore classificazione dei casi in GS+/CTNNB1+, GS+/CTNNB1- ha dimostrato come solamente i primi raggiungessero la significatività statistica. Sono state identificate 13 mutazioni di cui 1 delezione mononucleotodica e 12 mutazioni missenso coinvolgenti prevalentemente i codoni 32, 33, 37 e 45. Otto mutazioni risultavano in HCC GS+/CTNNB1+, quattro in HCC GS+/CTNNB1-, una in HCC GS/CTNNB1- (p=0.023). Sono state trovate frequenti perdite alleliche a livello dei bracci cromosomici 8p (58%), 16p (52%), 1p (50%), 17p (48%) e 19q (32%). Sono emerse significative differenze in relazione ad una serie di variabili clinico-patologiche e molecolari. LOH in D8S136 e D17S520 correlavano con l’età del paziente. Perdite alleliche in 16p e 19q erano frequenti in pazienti con cirrosi. Caratteristiche di aggressività tumorale quali invasione e grado correlavano con LOH in 17p. Perdite in 1p, 8p e 19q erano tipiche di noduli con dimensioni maggiori (>3 cm). Alcune LOH segregavano in relazione all’attivazione o meno di Wnt (immunoreattività e/o mutazioni di CTNNB1): D17S1358, D17S520, D8S1477 in casi positivi; D1S255, D8S136 e D16S753 in casi negativi. Il pattern di LOH in relazione alla progressione neoplastica ha dimostrato come la maggior parte delle perdite alleliche occorra negli stadi neoplastici più avanzati. Sulla base delle caratteristiche morfologiche, l'espressione immunoistochimica di GS e/o CTNNB1 e le mutazioni del gene CTNNB1, è possibile definire un sottotipo di HCC predittivo dell’attivazione della via di segnale Wnt. Patterns di LOH si associano a specifiche regioni cromosomiche rilevanti per l'epatocarcinogenesi e / o la progressione del tumore; ciò può aiutare ad individuare presunti geni soppressori tumorali.

Introduction and purpose: The molecular basis of hepatocellular carcinoma (HCC) are complex and determined by the interaction of genetic and environmental factors specific to individual patients, characterizing each tumor as a distinct clinical-pathological entity. Subtypes of HCC can be defined integrating clinical and pathological parameters, mutation analysis and gene profiling. It has recently been shown that HCCs with activation of the Wnt pathway have distinct morphology and improved survival. These tumors are characterized by mutations and / or nuclear immunoreactivity for β-catenin (CTNNB1), by overexpression of glutamine synthetase (GS) and are associated with specific gene expression profiles. We evaluated the clinico-pathological and molecular correlations in a series of HCCs characterized by activation of the Wnt signaling pathway.

Materials and Methods Surgical resection of 84 HCCs from 77 patients were investigated by immunohistochemical expression of GS and/or CTNNB1, mutational analysis of the CTNNB1 gene, and allelic losses (LOH) in chromosome arms 1p, 8p, 16p, 17p and 19q using a panel of eighteen microsatellite markers. In tumors showing distinct areas of neoplastic progression, the analysis was performed in all components to assess the timing of LOH acquisition .

Results The tumors were divided two groups based on tissue immunoreactivity for GS and/or CTNNB1, 56 cases (GS +) and 28 controls (GS-). HCC GS+ were characterized by viral etiology (p = 0.05), larger size (> 3 cm) (p = 0.05), expansive growth pattern (0.003), and peritumoral capsule (p> 0.001). Further stratification of cases into GS+/CTNNB1+, GS+/CTNNB1- indicated that most of the contribution to statistical significance was related to the first subgroup. 13 mutations of the CTNNB1 gene were identified, 1 single nucleotidic deletion and 12 missense mutations, mainly involving codons 32, 33, 37 and 45. Eight mutations occurred in HCC GS+/CTNNB1+, four in GS+/CTNNB1-, and 1 in GS-/CTNNB1- (p = 0.023). The frequency of LOH was high at all chromosome arms, 8p (58%), 16p (52%), 1p (50%), 17p (48%), and 19q (32%). Significant differences were observed in relation to a series of clinicopathological and molecular parameters. LOH in D8S136 and D17S520 correlated with patients’age. Allelic losses in 16p and 19q were frequent in patients with cirrhosis. Features of tumor aggressiveness, such as vascular invasion and histologic grade, correlated with 17p LOH. LOH in 1p, 8p and 19q were observed in larger nodules (>3 cm). Some LOH segregate, differently according to the Wnt status (CTNNB1 immunoreactivity and / or mutations): D17S1358, D17S520, D8S1477 in positive cases; D1S255, D8S136 and D16S753 in negative cases. The pattern of LOH in relation to tumor progression showed that the majority of allelic losses were acquired in advanced stages.

Conclusions Based on morphological features, immunohistochemical expression of GS and / or CTNNB1, and CTNNB1 gene mutation status, a subtype of Wnt-activated HCCs can be defined. LOH patterns point to chromosomal regions relevant to hepatocarcinogenesis and/or tumor progression and can help to identify putative tumor suppressor genes.