Electrical competence of the infarcted heart following stem cell based regenerative therapy, in a rat model.

Abstract

Il trattamento basato sulla mobilizzazione/impianto di cellule staminali di diversa origine può accompagnarsi ad insorgenza di fenomeni aritmici anche letali. Le cellule progenitrici residenti cardiache (CPCs) dovrebbero rappresentare le cellule di elezione per la ricostituzione del tessuto miocardico danneggiato senza avere effetti pro-aritmici, essendo già programmate verso un fenotipo cardiaco. Questo studio è stato principalmente volto a valutare l’efficacia della mobilizzazione delle CPCs nel migliorare la competenza funzionale elettrica del cuore rigenerato, in modelli di ratto con infarto cronico o ischemia acuta. Protocollo A (infarto cronico). Sono stati usati 133 ratti Wistar maschi adulti. In 60 animali, le CPCs venivano mobilizzate, un mese dopo l’induzione dell’infarto, mediante iniezione intramiocardica di due fattori di crescita (growth factors: GFs, gruppo MI+GF): fattore di crescita epatico (HGF) e Fattore di crescita insulino-simile 1( IGF-1). In 55 ratti infartuati e in 18 animali sottoposti ad intervento simulato veniva iniettato solo veicolo (V: gruppi MI+V e SO+V). In sottogruppi di ogni campione sperimentale, prima e a distanza di 15 giorni dall’iniezione di GF/V, si valutava l’efficienza funzionale elettrica e meccanica del cuore mediante: (i) registrazione telemetrica dell’ECG nell’animale conscio e libero da costrizioni, (ii) registrazioni di elettrogrammi multipli simultanei dalla superficie epicardica per determinare le proprietà elettrofisiologiche tissutali, in termini di eccitabilità, conduzione e refrattarietà e (iii) misure ecocardiografiche. Inoltre, prima del sacrificio si effettuavano misure emodinamiche invasive. I cuori venivano quindi sottoposti ad indagini morfometriche, immunoistochimiche e di biologia molecolare. Rispetto agli animali non trattati (MI+V), il gruppo MI+GF mostrava una significativa riduzione dell’aritmogenesi ventricolare associata ad un prolungamento del periodo refrattario effettivo (ERP) senza modificazioni della dispersione della refrattarietà e della durata del processo di ripolarizzazione come indicato dalle misure di QTc e dai livelli di RNAm per le subunità α Kv4.2 e Kv4.3 del canale potassio (Ito). Il trattamento riduceva l’ipertrofia reattiva dei cardiomiociti, l’entità della fibrosi interstiziale ed il rimodellamento sfavorevole del ventricolo. Le citochine infine promuovevano la formazione di nuovi cardiomiociti connessi elettricamente e meccanicamente e di nuovi vasi, come indicato dalla densità di cellule BrdU positive e dalla distribuzione della Connessina43 e N-caderina, e abolivano la relazione tra dimensione dell’infarto e deterioramento della funzione meccanica del cuore. In conclusione, la somministrazione intramiocardica di GFs si è dimostrata efficace nel migliorare la competenza elettromeccanica del cuore, nell’infarto cronico. La ridotta aritmogenesi è attribuibile al prolungamento del periodo refrattario conseguente al miglior accoppiamento elettrico intercellulare ed alla attenuazione del rimodellamento ventricolare sfavorevole. Protocollo B (ischemia acuta). Sono stati studiati 23 ratti Wistar maschi di 4 mesi di età. In 17 animali si eseguiva una legatura della coronaria sinistra per l’induzione dell’infarto miocardico, nei rimanenti 6 animali si procedeva ad intervento simulato (SO). A distanza di 4 ore dalla legatura, si procedeva alla iniezione intramiocardica di 2 microg di proteina nucleare “High-mobility group box 1” (HMGB1; n=7, gruppo MI+HMGB1). Nei rimanenti 10 animali con ischemia acuta e nei 6 ratti SO si eseguiva un’iniezione intramiocardica di 2 microg della forma inattivata della proteina. La vulnerabilità alle aritmie è stata valutata, come nel protocollo A, mediante registrazioni telemetriche dell’ECG in condizioni basali e durante esposizione a condizioni di stress, nell’animale conscio. Per confronto con gli animali SO, i ratti non trattati mostravano un significativo incremento del numero di eventi aritmici ventricolari sia spontanei sia indotti dall’esposizione allo stress. L’iniezione intramiocardica di HMGB1 aboliva completamente l’aumento dell’aritmogenesi ventricolare suggerendo un effetto protettivo del trattamento. Benché ulteriori studi siano necessari per analizzare i meccanismi alla base dell’azione antiaritmica del trattamento, è ipotizzabile che un ruolo importante venga svolto non solo dai processi rigenerativi indotti da HMGB1 con conseguente riduzione del rimodellamento ventricolare sfavorevole, ma anche dalla corretta integrazione elettromeccanica del tessuto neoformato con il tessuto risparmiato dall’infarto.

Heart repair by stem cell treatment may involve life-threatening arrhythmias. Cardiac progenitor cells (CPCs) appear best suited for reconstituting lost myocardium without posing arrhythmic risks, being commissioned towards cardiac phenotype. In this study we tested the hypothesis that mobilization of CPCs via intra-myocardial delivery of either (i) Hepatocyte Growth Factor and Insulin-Like Growth Factor-1 (HGF+IGF-1) in a rat model of chronic myocardial infarction, or (ii) High-mobility group box 1 protein (HMGB1) in acute ischemia, is not proarrhythmic. Protocol A (chronic myocardial infarction). We used 133 adult male Wistar rats either with one-month old MI and treated with growth factors (GFs, n=60) or vehicle (V, n=55), or sham operated (n=18). In selected groups of animals, prior to and two weeks after GF/V delivery, we evaluated stress-induced ventricular arrhythmias by telemetry-ECG, cardiac mechanics by echocardiography, and ventricular excitability, conduction velocity and refractoriness by epicardial multiple-lead recording. Also, invasive hemodynamic measurements were performed before the hearts were subjected to anatomical, morphometric, immunohistochemical, and molecular biology analyses. When compared with untreated MI, GFs decreased stress-induced arrhythmias and concurrently prolonged the effective refractory period (ERP) without affecting neither the duration of ventricular repolarization, as suggested by measurements of QTc interval and mRNA levels for K-channel α-subunits Kv4.2 and Kv4.3, nor the dispersion of refractoriness. Further, markers of cardiomyocyte reactive hypertrophy, including mRNA levels for K-channel α-subunit Kv1.4 and β-subunit KChIP2, interstitial fibrosis and negative structural remodeling were significantly reduced in peri-infarcted/remote ventricular myocardium. Finally, analyses of BrdU incorporation and distribution of connexin43 and N-cadherin indicated that cytokines generated new vessels and electromechanically-connected myocytes and abolished the correlation of infarct size with deterioration of mechanical function. In conclusion, local injection of GFs ameliorates electromechanical competence in chronic MI. Reduced arrhythmogenesis is attributable to prolongation of ERP resulting from improved intercellular coupling via increased expression of connexin43, and attenuation of unfavorable remodeling. Protocol B (acute ischemia). Twenty-three, 4-month old male Wistar rats were used in the study. Myocardial infarction was induced in 17 rats, the remaining 6 animals were sham-operated. After 4 hours, the animals were re-operated and injected with: (i) 2 microg of purified HMGB1 (7 MI rats, MI+HMGB1 group), or (ii) 2 microg of inactive protein (10 MI rats and 6 sham operated animals: MI+boxA and SO groups). As in Protocol A, arrhythmia vulnerability was evaluated by means of telemetry ECG recordings, in conscious freely moving animals. In comparison with SO, MI+boxA rats showed a significantly higher number of ventricular arrhythmic events during both baseline and stress conditions. The increased proneness to arrhythmias was completely abolished in HMGB1-treated animals, suggesting a protective effect of protein injection against spontaneous arrhythmias as well as arrhythmias triggered by sympathetic stimulation. Although further studies are required to better understanding the mechanisms underlying the anti-arrhythmic action of the treatment, in accordance with previous studies this result can be at least in part ascribed to the HMGB1-induced cardiac regeneration resulting from CPC activation associated with a proper electro-mechanical integration of the newly formed tissue with the spared ventricular myocardium.