Development of PNA-based systems for food safety and molecular biology

Abstract

Il presente lavoro di tesi è stato incentrato sullo sviluppo di metodi per applicazioni riguardanti la sicurezza alimentare e la biologia molecolare. L’analisi di norovirus è stata studiata mediante metodi basati sull’utilizzo di Acidi Peptido Nucleici (PNA): i) un PNA-microarray è stato sviluppato per l’analisi e la determinazione del genogruppo di norovirus; ii) sonde a PNA coniugate con arancio di tiazolo (TO) sono state sviluppate ed utilizzate per l’analisi di norovirus mediante un metodo isotermo di amplificazione, analizzando gli amplificati costituiti da RNA; iii) un nuovo approccio per la concentrazione di norovirus dall’acqua e sucessiva analisi mediante real time RT-PCR è stato investigato. Più in generale, sonde a PNA coniugate con pirene sono state sviluppate per l’analisi di sequenze specifiche e per la determinazione di ‘polimorfismi a singolo nucleotide’ (SNPs). In particolare, un sistema basato su una coppia di sonde è stato utilizzato per l’analisi del polimorfismo PTPN22 C1858T, implicato in svariate malattie autoimmuni incluso il diabete di tipo 1.

The work has been focused on the development of molecular methods for food safety and molecular biology applications. Norovirus detection has been investigated by Peptide Nucleic Acid (PNA)-based methods: i) a PNA-microarray has been developed and used for the detection and genogroup differentiation of norovirus; ii) thiazole orange (TO) conjugated PNA-probes have been developed and employed for norovirus analysis using an isothermal-based amplification method, targeting RNA; iii) a new approach for the concentration of norovirus from water followed by real time RT-PCR analysis has been investigated. In a more general approach, pyrene-conjugated PNA probes have been developed for the analysis of specific sequences and single nucleotide polymorphism (SNP) detection. In particular, a dual-probe system has been developed for the detection of the PTPN22 C1858T polymorphism implicated in several human autoimmune diseases including type 1 diabetes.