Structure and dynamics of bio-hydrogels investigated by neutron and X-ray scattering techniques

Abstract

Hyaluronic acid (HYA) is a natural polysaccharide, belonging to the family of glycosaminoglycans, characterized by the repetition of a disaccharide unit of glucuronic acid and N-acetylglucosamine. HYA is present throughout the animal kingdom, from the extracellular matrices in which most tissues differentiate, to the vitreous of the human eye and the synovial joint fluid. Thanks to its ability to form viscous solutions in water, HYA is widely used to treat inflammatory and degenerative joint diseases, a group of pathologies with a high impact in society since they contribute heavily to the rise of health costs and they affect life quality. Beside HYA, we investigated a chemically modified form of hyaluronic acid, HYADD, obtained derivatizing the polysaccharide backbone with hexadecylic (C-16) side chains, through amide bonds, with a 1-3 mol-% degree of substitution of repeating units. Even if the modification is very small, it alters dramatically some macroscopic properties such as the elastic behavior and the rheological response. The resulting system is a relatively stable hydrogel at polymer concentrations higher than 0.3% (weight of polymer/total volume), whereas native hyaluronic acid forms highly viscous solutions only at concentrations ten times higher. HYADD, however, does not differ from HYA in other relevant features such as charge density along the chain and swelling ability, as well as in its interaction behavior with metabolites and cellular material in the synovial matrix. On the basis of the beneficial effects noticed in recent tests performed on animal models of osteoarthritis, HYADD is expected to have a positive clinical effect in joint mobility and function.

The aim of this PhD thesis is to compare the natural gel and the chemically modified one focusing on microscopic structural and dynamic properties such as the structure and organization of the polymer chains, the dynamics of the polymer and the self-diffusivity of water in the gels. We have performed several experiments using X-ray and neutron scattering to probe gels at different polymer concentrations and temperatures. From the structural point of view we found that HYADD has a structure more compact than HYA owing to the hexadecylic branches added along the chain. The characteristic lengths derived from neutron and X-ray experiments (~ 150 Å) are in fair agreement with those resulting from dynamics light scattering measurements. The small angle diffraction patterns show, in addition, the presence of some degree of order in the organization of the natural saccharide chain in the most concentrated gels. The dynamics of HYA and HYADD shows some small differences in the 100-1000 ps timescale (mostly in the low-Q region) that can be related to the presence of the chemical modification. On the other hand the diffusive dynamics of gel water is similar to that of bulk water for both HYA and HYADD gels at least up to 10% gel concentration.

In the frame of a collaboration with the group of Prof. Santi at the Department of Pharmacy of Parma University, we contributed to the characterization of a novel platform called Patch-non Patch®, developed for transdermal drug delivery. In particular, using quasielastic neutron scattering we investigated the diffusivity of a model drug (lidocaine) through the patch. The obtained data indicate that the diffusion of lidocaine is triggered by that of hydration water present in the patch.

In the framework of a CNR PhD grant, I spent 18 months at the Institut Laue Langevin in Grenoble, where I joined the group of Italian and French researchers in charge of the backscattering spectrometer IN13. Under the supervision of Dr. Francesca Natali, I took part to the group activities, contributing to the technical developments and to the assistance to users during their experiments.

L'acido ialuronico (HYA) è un polisaccaride naturale, appartenente alla famiglia dei glicosaminoglicani, caratterizzato dalla ripetizione di un' unità disaccaridica composta da acido glucuronico ed N-acetilglucosammina. Lo HYA è presente in tutto il regno animale, dalle matrici extracellulari in cui molti tessuti si differenziano, all'umor vitreo dell'occhio umano, al fluido sinoviale in corrispondenza delle giunture. Grazie alla sua abilità di formare soluzioni viscose in acqua, lo HYA è ampiamente impiegato nei trattamenti delle malattie infiammatorie e degenerative delle articolazioni, un gruppo di patologie con elevato impatto sociale in quanto fortemente legate all'aumento dei costi sanitari ed alla qualità della vita.

Dell'acido ialuronico abbiamo studiato anche una forma chimicamente modificata, lo HYADD, ottenuta derivatizzando, attraverso legami ammidici, la catena principale del polisaccaride con catene laterali esadeciliche (C-16) con un grado di sostituzione dell'1-3% delle unità ripetitive. La modifica, pur essendo piccola, altera drammaticamente alcune delle proprietà macroscopiche come il comportamento elastico e la riposta reologica del polimero. Con lo HYADD si ottiene un idrogel relativamente stabile a concentrazioni polimeriche superiori allo 0.3% (peso polimero/ volume totale), mentre l'acido ialuronico naturale forma soluzioni viscose a concentrazioni dieci volte superiori. Lo HYADD, tuttavia, non differisce dallo HYA in altre caratteristiche importanti quali la densità di carica lungo la catena, l'abilità di 'swelling' o il comportamento d'interazione con metaboliti e materiale cellulare nella matrice sinoviale. Sulla base degli effetti benefici notati in recenti test condotti su modelli animali di osteoartrite, si pensa che lo HYADD possa avere effetti clinici positivi nella mobilità e nella funzione delle articolazioni.

Lo scopo principale di questa tesi è quello di confrontare il gel naturale e quello chimicamente modificato sulla base di proprietà strutturali quali l'organizzazione delle catene polimeriche e di proprietà dinamiche come la micro diffusività dell'acqua nel gel. Per studiare i due sistemi polimerici in diverse condizioni di temperatura e concentrazione, abbiamo condotto diversi esperimenti di scattering di raggi X e neutroni. Dal punto di vista strutturale abbiamo scoperto che lo HYADD ha una struttura più compatta dello HYA, dovuta ai bracci laterali presenti lungo la catena principale. Le lunghezze caratteristiche (~150 Å) derivate dagli esperimenti di neutroni e raggi X, sono in buon accordo con quelle risultanti dalle misure di scattering dinamico della luce. Sui gels più concentrati, inoltre, i patterns di diffrazione a basso angolo mostrano la presenza di qualche grado d'ordine nell'organizzazione della catena saccaridica di HYA. La dinamica delle catene di HYA e HYADD mostra alcune piccole differenze sulla scala temporale tra i 100 e i 1000 ps (principalmente nella regione a bassi Q), che può essere collegata alla presenza della modifica chimica. La dinamica diffusiva dell'acqua nel gel invece risulta simile a quella dell'acqua bulk sia per lo HYA che per lo HYADD, almeno fino ad una concentrazione del 10%.

Nel contesto di una collaborazione col gruppo della Prof.ssa Santi del Dipartimento di Farmacia dell'Università di Parma, abbiamo contribuito alla caratterizzazione di una nuova piattaforma chiamata Patch-non Patch®, sviluppata per il trasporto transdermico del farmaco. In particolare, abbiamo studiato la diffusività di un farmaco modello (lidocaina) attraverso il cerotto con lo scattering quasi-elastico di neutroni. I dati ottenuti indicano che la diffusione della lidocaina è triggerata da quella dell'acqua di idratazione presente nel cerotto.

Grazie al finanziamento del CNR, ho potuto trascorrere 18 mesi all' Institut Laue Langevin a Grenoble, ospite del gruppo di ricercatori italo-francesi responsabili dello spettrometro a retrodiffusione IN13. Sotto la supervisione della Dott.ssa Francesca Natali, ho partecipato alle attività del gruppo, contribuendo ad esempio agli sviluppi tecnici e all'assistenza degli utilizzatori durante gli esperimenti.