Structure and Dynamics of Lipid/Saccharide Complexes

Abstract

Il mio lavoro di tesi ha riguardato la caratterizzazione della struttura e della dinamica atomica di sistemi per la somministrazione e veicolazione di farmaci non solubili in acqua. Le loro proprietà, sia strutturali che dinamiche, sono alla base del corretto funzionamento di tali vettori. Il progetto nasce da una collaborazione con il gruppo del Prof. Colombo del Dipartimento Farmaceutico dell'Università di Parma; il lavoro svolto da questo gruppo ha infatti riguardato la progettazione dei sistemi studiati e la loro caratterizzazione per possibili applicazione farmaceutiche. Un sistema per il trasporto di un farmaco deve dimostrare capacità di incapsulamento, solubilizzazione, rilascio ottimale, stabilità a lungo termine e bassa tossicità. I sistemi colloidali come micelle, liposomi, vescicole, cristalli liquidi e particelle nanometriche sono state indicati, negli ultimi 15-20 anni, come sistemi molto promettenti per la veicolazione di farmaci. L'incapsulamento di molecole attive all'interno dei vettori non solo le protegge dall'attacco chimico e enzimatico a cui sarebbero altrimenti esposte ma rende possibile il controllo sia del sito di rilascio, sia della cinetica di tale processo. Tra i sistemi colloidali quelli a base liposomiale sono stati maggiormente studiati; alcuni sono attualmente impiegati e altri in fase di certificazione. Per le loro caratteristiche strutturali i liposomi possono essere usati per veicolare sia sostanze idrosolubili sia quelle lipofile. La struttura del liposoma è infatti caratterizzata da un nucleo centrale acquoso in cui la prima classe di molecole può essere racchiusa e protetta dall'ambiente esterno (anch'esso acquoso). La regione che si interfaccia tra i due ambienti è tipicamente un doppio strato lipidico. Questo strato è caratterizzato da una zona centrale altamente lipofila in cui molecole idrofobiche possono essere solubilizzate, e come nel caso precedente, protette dall'ambiente esterno. Tuttavia l'impiego di puri liposomi come vettori presenta alcune limitazioni; la principale è la scarsa stabilità temporale del sistema e la difficoltà di ottenere elevati livelli di bio-adesione. Per questo motivo sono stati recentemente sviluppati sistemi composti da una parte lipidica e una saccaridica. L'aggiunta della componente saccaridica induce infatti maggior stabilità strutturale al sistema, fornisce maggior protezione contro la degradazione enzimatica e soprattutto rende le particelle altamente bio-adesive. In particolare, l'uso combinato di lipidi e zuccheri elettrostaticamente carichi (ionici) ha dato i migliori risultati. I vettori studiati in questo lavoro sono nanoparticelle lipido/saccaridiche sviluppate per la veicolazione di farmaci lipofili (non solubili in acqua). La componente lipidica adottata è lecitina di soia. Questa scelta è stata dettata dalla necessità di sviluppare un sistema con costi contenuti per un eventuale scale-up a livello industriale. La lecitina utilizzata (Lipoid S45) è infatti una miscela commerciale di diversi fosfolipidi e acidi grassi. La sua composizione è tale da indurre una carica netta negativa ai lipidi; si tratta quindi di una miscela anionica. La componente saccaridica è invece chitosano, un polisaccaride lineare caratterizzato dalla presenza di un residuo amminico per ogni monomero. In ambiente acido (pH<5) questo residuo lega un protone dal solvente inducendo una carica positiva netta allo zucchero. Grazie a questa carica il chitosano mostra un elevato potere di adesione sulle pareti cellulari, caratteristica che facilita la cattura dei vettori da parte delle cellule. Entrambe le componenti sono largamente utilizzate in ambito medico, farmaceutico e alimentare; sono considerate infatti bio-compatibili e atossiche. Le particelle studiate in questo lavoro sono originate dall'auto aggregazione delle molecole lipidiche e dalla loro contemporanea interazione con la componente saccaridica. Le forze che guidano il processo di self-assembly sono principalmente due: l'interazione idrofobica e quella elettrostatica. Ne consegue la formazione di particelle sferiche, con dimensioni caratteristiche dell'ordine di poche centinaia di nanometri, come risulta da misure di microscopia elettronica e scattering dinamico di luce. La loro struttura interna è stata invece studiata tramite diffrazione a basso angolo di neutroni e raggi X. I risultati della caratterizzazione strutturale sono illustrati nel capitolo "Structural characterization:results & discussion". Ne è emersa una struttura caratterizzata da un nucleo centrale acquoso circondato da una ripetizione ordinata di doppi strati lipidici separati l'uno dall'altro da una regione contenente solvente e chitosano. Tali sistemi sono inoltre caratterizzati da una carica superficiale non nulla: il processo di self-assembly non si ferma una volta raggiunto, in termini di composizione, il bilancio di carica ma una maggior quantità di polielettrolita viene adsorbito sulla superficie delle nanoparticelle. Tale comportamento, descritto come re-entrant condensation effect, ha origine entropica ed è legato all'instaurazione di un ordine locale del polisaccaride sulla superficie del doppio strato lipidico. Il numero di strutture doppio strato-chitosano per nanoparticella (grado di multilamellarità) è risultato determinato dal rapporto lecitina/chitosano utilizzato in fase di preparazione. La multilamellarità del sistema è risultata direttamente correlata anche alla capacità di questi sistemi di incapsulare una sostanza lipofila. Più è elevato il numero di particelle multi lamellari (a partire dalla stessa quantità di lipidi) maggiore è la quantità di molecole che è possibile incapsulare. Questa abilità e il corrispondente processo spontaneo di rilascio del farmaco sono stati analizzati utilizzando due principi attivi di prova: progesterone (PG) e tamoxifene citrato (TAM). Il primo un ormone femminile che viene utilizzato come farmaco, mentre il tamoxifene è un principio attivo somministrato nella cura e prevenzione del tumore al seno. Entrambe le molecole sono lipofile e hanno una bassissima solubilità in acqua (8 μg/ml e 14 μg/ml rispettivamente). La differenza tra le due sostanze è la carica elettrostatica portata: il PG è neutro mentre il TAM è positivamente carico e può quindi interagire attrattivamente con la lecitina e repulsivamente con il chitosano. La loro solubilità risulta decisamente aumentata se incapsulati nelle nanoparticelle, si ottengono infatti valori di 100 μg/ml per il PG e 600 μg/ml per il TAM. Se si considera che la concentrazione delle sole nanoparticelle in soluzione è pari allo 0.02%, corrispondente a 2.1 mg/ml, i valori di solubilità modificata risultano notevoli. L'ulteriore aggiunta di eccipienti farmaceutici (come l'isopropil-miristato, IPM) permette, nel caso del progesterone, di incrementarne la solubilità fino a 1500 μg/ml. Quest'aumento è stato confrontato con le modifiche indotte dall'IPM nella struttura delle nanoparticelle e ha confermato la diretta correlazione tra multilamellarità e potere di incapsulamento. Le particelle caricate con il tamoxifene hanno proprietà strutturali diverse da quelle di particelle vuote o caricate con un farmaco neutro. Da misure di diffrazione a basso angolo di neutroni e raggi X è emerso che il chitosano non prende parte alla formazione delle particelle che risultano quindi composte da una ripetizione ordinata di doppi strati lipidici contenenti tamoxifene. La regione tra due doppi strati consecutivi, che prima era composta da solvente e chitosano, è ora invece riempita di sola acqua. Questo effetto risulta indotto dalla repulsione elettrostatica tra il farmaco e lo zucchero. L'assenza del chitosano dalle particelle è stata confermata da misure colorimetriche; il polisaccaride rimane quindi in soluzione sotto forma di catena estesa. Le analisi di incapsulamento e quelle strutturali hanno permesso di determinare il rapporto ottimale tra chitosano e lecitina da utilizzare per ottenere particelle stabili con un'elevata capacità di carico per diversi farmaci. Tale rapporto è risultato essere di 1 a 20 (chitosano/lecitina in peso; sistema indicato come NCL20). Sono stati quindi condotti esperimenti di rilascio dei farmaci per nanoparticelle caricate con PG, in assenza e presenza di IPM, e con TAM: NCL20+PG, NCL20+IPM+PG e NCL20+TAM. I dati ottenuti dal gruppo del Prof. Colombo mostrano che una parte del farmaco incapsulato, rispettivamente il 25%, 95% e 0%, risulta rilasciato spontaneamente dalle particelle entro due ore dalla preparazione. Oltre questo limite temporale non si è osservato alcun ulteriore rilascio. Per tutti i sistemi una certa quantità di farmaco, sempre molto elevata rispetto alla solubilità del solo principio attivo in acqua, rimane incapsulata nella particella. Un rilascio completo del farmaco può essere quindi ottenuto solo attraverso un'efficiente degradazione enzimatica del sistema. L'uso di lipasi, un enzima capace di smantellare i doppi strati lipidici, ha prodotto un rilascio del 100% per il sistema NCL20+TAM. Si è dimostrato invece inefficace per i sistemi NCL20+PG; queste particelle sono state completamente degradate aggiungendo alle lipasi il lisozima. Questo enzima è infatti capace di idrolizzare la componente saccaridica. L'azione sinergica dei due enzimi ha permesso di ottenere, per i sistemi caricati con PG, rilasci modificati pari al 100% del farmaco incapsulato. La scelta di lipasi e lisozima e la giustificazione del loro diverso funzionamento su sistemi caricati con PG e con TAM non sarebbe stata possibile in assenza di informazioni dettagliate sulla diversa struttura interna dei due tipi di particelle. La caratterizzazione della dinamica locale (su scala atomica) delle nanoparticelle è stata effettuata tramite diffusione elastica e quasielastica di neutroni. Queste due tecniche ci hanno permesso di determinare le energie caratteristiche dei moti atomici del sistema e di vedere come questi sono influenzati da variazioni di temperatura e dalla presenza di farmaci o eccipienti. Tramite questa caratterizzazione è stato possibile spiegare le diverse cinetiche di rilascio spontaneo del farmaco osservate con tecniche farmaceutiche. I risultati ottenuti sono illustrati nel capitolo "Dynamical Characterization: results & discussion" La maggior parte delle analisi strutturali e dinamiche, fatte a partire da un sistema multi-componente e complesso, è stata ripetuta su un sistema modello per verificare se i risultati potessero essere estesi a una gamma più ampia di sistemi lipido-saccaridici o fossero propri dei due componenti scelti. La lecitina è stata quindi sostituita con una miscela binaria di lipidi puri (98% POPC e 2% DMPS) che si aggregano in liposomi con dimensioni e carica superficiale simili a quelle osservate in vescicole di lecitina. Il chitosano, carico solamente a pH acido, è stato sostituito con il trimetil-chitosano, la cui carica è pH indipendente. durante la caratterizzazione, sia della struttura che della dinamica, di queste nuove particelle è stato possibile utilizzare modelli matematici più dettagliati e più vincolati ai parametri fisici delle molecole in gioco. I risultati hanno confermato, con più accuratezza, i risultati principali emersi dallo studio delle particelle di lecitina e chitosano. Nel caso della diffusione quasielastica di neutroni, l'uso della miscela binaria, ha permesso di capire quali dinamiche atomiche sono più o meno influenzate dall'aggiunta della componente saccaridica e da variazioni di temperatura. Nei capitoli della tesi sono riportati i risultati principali sui campioni completamente caratterizzati. I risultati delle analisi strutturali sono riportati in maggiore dettaglio negli articoli originali presenti in forma di appendice.

Since the mid '90s, colloidal carriers such as liposomes, micelles, micro-emulsions and nanoparticles have been used as drug delivery systems for effective administration of drugs having biopharmaceutical problems, such as severe side effects, low stability in biological fluids, specific organ toxicity, low bioavailability or poor aqueous solubility. Encapsulation into nano-sized carriers not only protects the active species from chemical and enzymatic degradation, but also makes it possible to localize the release process and to tune its kinetics. Biocompatible particles suitable as drug delivery systems can be built up using a variety of materials including polymers (polymeric nanoparticles, micelles, or dendrimers), lipids (liposomes), gels and hydrogels, microemulsions and viruses (viral nanoparticles). Among these systems, great attention has been addressed to particles obtained from ionic lipids with polyelectrolytes as stabilizing agents. During this thesis work I have characterized the structure, the morphology and the local dynamics of lecithin-chitosan nanovectors, developed in order to increase the solubility of lipophilic drug molecules and to reduce the drug toxicity for healthy cells during the delivery process. The development of the systems as well as the study of their pharmaceutical properties have been performed by the group of Prof. Colombo from the Pharmaceutical Department of the University of Parma. Lecithin is a lipid mixture of phospholipids that is currently used for liposome and micelle formation; it is largely employed in pharmaceutical formulations. Chitosan, a cationic polysaccharide derived from chitin by deacetylation, has emerged as stabilizing agent because of low toxicity, high biocompatibility and absorption enhancer properties. Lecithin/chitosan nanoparticles were obtained from the supramolecular self-organizing interaction between the negatively charged lipid component and the positively charged polysaccharide. Cryo-TEM, dynamic light scattering, and small-angle X-ray and neutron scattering have been used to work out a detailed structural model of the particles. They are characterized by a hollow aqueous core surrounded by a multilayer structure (lipid bilayers separated by a chitosan-water interlayer); the number of layers depends on the lecithin/chitosan ratio and it affects both the drug-loading efficiency and the kinetics of drug release. The particles have been loaded with Progesterone, a neutral lipophilic drugs; in this way it is possible to increase its solubility by a factor 16 with respect to that of the drugs alone (6 μg/ml). Further addition of excipients like isopropyl-myristate (IPM) raises this level up to 1800 μg/ml without changing the main structural features of the lecithin/chitosan particles. Particles loaded with a lipophilic and positively charged drug (Tamoxifen Citrate, TAM) have been characterized in a similar way. The TAM molecules induce a positive surface charge into the vesicles, repelling the positively charged chitosan which therefore does not take part in the nanoparticle formation. Drug release tests from the above particles have shown that 25% of the encapsulated drug molecules are released within two 2hrs since particle preparation. This amount can be increased up to 95% upon addition of IPM. In the case of particles loaded with TAM no release occurs up to 6 days from the preparation. In all the analysis performed on "loaded" particles a certain amount of drug is never released and appears to be permanently trapped within the particle. To obtain a full release of the drug it is necessary to have a detailed knowledge of the inner structure of particle and of its outer shell, in order to design an efficient selective enzymatic degradation. Release measurements, in presence of enzymes within the solution, have shown that TAM can be completely released using lipase, an enzyme that breaks down the lipid matrix; on the other hand, lipase alone does not affect significantly the lecithin/chitosan particles: here a complete release of the drugs can be achieved by the joint effect of lipase and lysozyme, an enzyme that hydrolyzes chitosan molecules. In this context a high detailed knowledge of the nanoparticle inner structure is a prerequisite to control and tune this release process. In order to get more insight on particle-solvent interactions and to better understand the mechanisms that can control kinetics of drug release occurring within 2hrs from drug encapsulation, the nanoparticle atomic dynamics has been studied using elastic- and quasi-elastic neutron scattering. Addition of polysaccharide reduces the lipid mobility improving thus the particle stability; on the other hand the initial lipid flexibility is restored adding isopropyl-myristate. These modifications lead, in turn, to macroscopic changes of the release kinetics. In order to investigate with higher detail the structure and the dynamics of lipid-saccharide particles, commercial lecithin has been replaced with a simpler and controlled lipid binary mixture of POPC and DMPS. With these starting molecules, adopting a 98/2 POPC/DMPS ratio it is possible to obtain liposomes that have structural and morphological features close to those of lecithin-based ones. These new particles have also been characterized using small angle- and quasielastic neutron scattering. In particular the use of simple components has allowed us to identify which parts of the particles were characterized by different motions. In particular a new model to analyze QENS data of pure-lipid vesicles has been developed. It has been applied to data taken with two spectrometers with different resolution.