Vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and exposure to natual infection by a heterologous field isolate: immune efficiency and neuroendocrine response in conventional pigs

Abstract

The functional characterization and quantification of the anti-viral immune response are particularly relevant with regards both to the study of the mechanisms mounted by the immune system to cope with infections and to the employment of new strategies for improving vaccination efficacy and immune protection. In this view, also the determination of systemic neuroendocrine modulation can be informative on the progression of infection since a bi-directional communication exists between the immune system and neuroendocrine axes. Hormones such as cortisol and growth hormone (GH) can act as immunomodulatory mediators, thus influencing the immune response to the pathogen and the severity of the associated disease. Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) represents one of the most important and deleterious viruses affecting the swine population. However, the interaction between PRRSV and the swine immune system is highly complex and still poorly understood, because of its ability of evading and dampening several immune responses and since different outcomes are observed upon vaccination and/or infection. Moreover, genetically and antigenically divergent viral strains make the development of efficacious vaccines even more difficult. In this thesis, before considering immune reactivity to PRRSV vaccination and infection, different immunological techniques and approaches of analysis were evaluated and optimized in order to properly measure anti-viral immune responses, with particular attention to cellular immunity (flow cytometry and ELISpot assay). Moreover, since much attention has been given to vaccine formulations and administration systems, an innovative needle-less intradermal (ID) vaccine delivery system (I.D.A.L.®) was assessed in comparison with the more conventional intramuscular (IM) route. The efficiency of needle-less intradermal vaccination was evaluated in a model of intense viral immune stimulation [Aujeszky’s Disease Virus (ADV)] in order to transfer such application to the more complex virus-to-host interaction observed upon PRRSV vaccination and infection. It was demonstrated that ID vaccination is able to elicit an intense immune response, strictly comparable to IM vaccination, both in terms of humoral (VN antibodies) and cellular (IFN-γ secreting cells, IFN-γ productivity per cell, IFN-γ responsiveness categories) immunity. Flow cytometric data showed a positive modulation of peripheral innate (NK) and adaptive (CD8β+) cytotoxic cells as well as of CD4-(CD8+)CD25+ activated and regulatory CD4+CD25+ T cells in ID-vaccinated animals. Also IFN-γ gene expression in PBMC was up-regulated in both groups.The qualitative and quantitative characterization of the immune response against PRRSV was then determined after vaccination (Lelystad-like vaccine strain) and subsequent natural infection by exposure to a heterologous field strain (Italian cluster virus, 84% homology) and associated with the degree of cross-protection and reduction of the disease. Besides immunological and clinical evaluations, also cytokine and hormonal activation were assessed. Compared to controls, vaccinated pigs (IM and ID groups) showed a reduction of the respiratory signs by 72% and 79% and of the overall clinical signs by 68% and 72%, respectively. Clinical protection was associated with marked activation of the cell-mediated immune response. The highest levels of PRRSV-specific IFN-γ secreting cells (mean levels and responsive animals identified by cut-off analysis) were associated with the increase of peripheral NK cells, γ/δ T lymphocytes and cytotoxic CD4-CD8+high T lymphocytes. Evidence of European vaccine-induced clinical protection against natural exposure to a genetically diverse PRRSV isolate (Italian cluster) was demonstrated by the statistically significant reduction of clinical signs in terms of incidence, duration and severity as well as by a more efficient cell-mediated immune response in vaccinated pigs as compared to unvaccinated controls. The early and prompt increase after PRRSV infection and the subsequent decrease to basal levels of IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1 and IFN-γ gene expression in PBMC of vaccinated animals, associated with temporally regulated endocrine modifications (cortisol and GH) and lower IL-10 expression levels, are a clear indication of both a more efficient responsiveness of peripheral innate immune cells (i.e. monocyte, NK cells) in the early phase of infection and a more efficient control of inflammation in a later phase. Furthermore, the degree of clinical protection was not affected by the route of vaccine administration, since intradermally vaccinated pigs using a needle-less injector did not show any significant difference in terms of clinical signs in comparison with intramuscularly vaccinated pigs. Overall, the results confirm that the ability of a PRRSV strain to induce a strong immune response is more important than the genetic similarity between vaccine and field strains in order to induce clinical protection.

La caratterizzazione funzionale e la quantificazione della risposta immunitaria anti-virale rivestono una notevole importanza sia nello studio dei meccanismi adottati dal sistema immunitario per contrastare le infezioni che nell’impiego di nuove strategie per il miglioramento dell’efficienza vaccinale e della protezione immunitaria. In quest’ambito, anche la determinazione della regolazione neuroendocrina sistemica può fornire informazioni sulla evoluzione dell’infezione, in quanto esiste una comunicazione bi-direzionale tra sistema immunitario ed assi neuroendocrini. Ormoni quali cortisolo e ormone della crescita (GH) sono in grado di agire come sostanze immunomodulatrici ed influenzare la risposta immunitaria verso un patogeno e la gravità della patologia ad esso associata. Il Virus della Sindrome Riproduttiva e Respiratoria (PRRSV) rappresenta uno dei più importanti virus causa di patologia per il suino. L’interazione tra PRRSV e sistema immunitario è però complessa e ancora scarsamente compresa, sia per la capacità di tale virus di evadere e deprimere varie risposte immunitarie, sia per i differenti scenari osservabili a seguito di vaccinazione e/o infezione. Inoltre, ceppi virali geneticamente e antigenicamente distinti rendono lo sviluppo di vaccini efficaci ancora più difficoltoso. Nella presente tesi, prima di considerare la reattività verso la vaccinazione e infezione da PRRSV, sono state valutate e ottimizzate differenti tecniche immunologiche e approcci di analisi al fine di quantificare appropriatamente le risposte anti-virali, con particolare attenzione all’immunità cellulare (citofluorimetria a flusso e tecnica ELISpot). Inoltre, siccome estrema importanza rivestono le formulazioni vaccinali ed i sistemi di somministrazione, un sistema innovativo di somministrazione intradermica (ID) senz’ago (I.D.A.L.®) è stato considerato in confronto alla più convenzionale somministrazione intramuscolare (IM). La efficienza della vaccinazione ID senz’ago è stata valutata in un modello di intensa stimolazione anti-virale [Aujeszky’s Disease Virus (ADV)] allo scopo di trasferire tale applicazione alla più complessa interazione virus-ospite osservata a seguito di vaccinazione e infezione da PRRSV. È stato dimostrato che la vaccinazione ID è in grado di indurre una intensa risposta immunitaria, altamente comparabile alla vaccinazione IM, sia in termini di immunità umorale (anticorpi virus-neutralizzanti) che cellulare (cellule secernenti IFN-γ, produttività di IFN-γ per cellula, classi di responsività IFN-γ-mediata). I dati citoflurimetrici hanno evidenziato una modulazione positiva di cellule immunitarie innate (cellule NK) e specifiche (linfociti T citotossici CD8β+) così come di cellule T attivate CD4-(CD8+)CD25+ e regolatorie CD4+CD25+ negli animali vaccinati per via intradermica. Anche l’espressione genica di IFN-γ nelle PBMC è risultata indotta in entrambi i gruppi di animali vaccinati. La caratterizzazione qualitativa e quantitativa della risposta immunitaria a PRRSV è stata quindi determinata a seguito di vaccinazione (ceppo vaccinale cluster Lelystad) e successiva infezione naturale indotta mediante esposizione a ceppo eterologo di campo (virus cluster italiano, 84% di omologia genomica) ed associata al grado di protezione crociata e riduzione della patologia. Parallelamente alla valutazione di parametri immunologici e clinici, è stata considerata anche l’attivazione citochinica ed ormonale. Rispetto agli animali di controllo, gli animali vaccinati (gruppi IM e ID) hanno mostrato una riduzione della sintomatologia respiratoria del 72% e 79% e della sintomatologia complessiva (sintomatologia respiratoria + sintomatologia sistemica) del 68% e 72% rispettivamente. La protezione clinica è risultata associata ad un’intensa attivazione della risposta cellulo-mediata. I livelli più elevati di cellule PRRSV-specifiche secernenti IFN-γ (livelli medi e animali responsivi identificati mediante cut-off) sono stati osservati in concomitanza e in associazione con l’incremento di cellule NK, linfociti T γ/δ e linfociti T citotossici CD4-CD8+high nel sangue. La protezione clinica indotta dal vaccino europeo nei confronti della esposizione naturale a ceppo di PRRSV geneticamente eterologo (cluster italiano) è stata dimostrata dalla riduzione statisticamente significativa della sintomatologia clinica in termini di incidenza, durata e gravità così come da una più efficiente risposta immunitaria cellulo-mediata negli animali vaccinati rispetto agli animali di controllo non vaccinati. Il precoce e rapido incremento dopo infezione da PRRSV e successivo ritorno a livelli basali dell’espressione genica di IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1 e IFN-γ nelle PBMC di suini vaccinati, associato a modificazioni endocrine (cortisolo e GH) temporalmente regolate e più ridotti livelli di espressione di IL-10, forniscono un quadro di più efficiente responsività di cellule periferiche dell’immunità innata (monociti, cellule NK) nella fase iniziale dell’infezione e un più efficiente controllo dello stato infiammatorio in una fase successiva. Inoltre, il grado di protezione clinica non è apparso influenzato dalla via di somministrazione del vaccino, in quanto i suini vaccinati per via intradermica utilizzando dispositivo senz’ago non hanno mostrato differenze significative in termini di sintomatologia clinica in confronto agli animali vaccinati per via intramuscolare. I risultati, complessivamente, confermano inoltre che la capacità di un ceppo di PRRSV di indurre una risposta immunitaria intensa riveste una maggior importanza rispetto alla similarità genetica tra ceppo vaccinale e ceppi di campo al fine di conferire una protezione clinica.