Marcatori molecolari in vertebrati di interesse zootecnico e conservazionistico

Abstract

In Italia lo studio genetico di popolazioni e specie è ancora carente sotto molti punti di vista, soprattutto per quanto riguarda l’analisi delle popolazioni sottoposte a gestione diretta da parte dell’uomo. Implementare le indagini per tutte le specie che mostrano lacune conoscitive circa i processi microevolutivi che le riguardano può essere una grandissima risorsa e un prezioso strumento per i gestori della fauna. Attraverso l’utilizzo di marcatori mitocondriali e nucleari è stata compiuta un’analisi del livello di differenziazione e dell’origine di popolazioni di alcune specie animali italiane: il capriolo (Capreolus capreolus), la cui importanza per scopi venatori la vede sottoposta a pratiche di ripopolamento e traslocazioni, non sempre in accordo con principi di conservazione; specie di lamprede non parassite italiane (Lampetra planeri e Lethenteron zanandreai) che, per interventi antropici di controllo di fiumi e torrenti, vedono compromessi molti degli areali di riproduzione e, di conseguenza, la riduzione della loro biodiversità; ed infine, la donnola (Mustela nivalis), il cui comportamento fortemente elusivo la rende poco studiata dal punto di vista genetico.

1. ORIGINE ED EVOLUZIONE DI POPOLAZIONI DI CAPRIOLO (Capreolus capreolus L.) DELL’APPENNINO SETTENTRIONALE Lo studio della variabilità mitocondriale (D-Loop) e della variabilità nucleare, attraverso marcatori RAPD e marcatori STR, di individui di capriolo ha permesso di esaminare la struttura genetica e di ipotizzare l’origine delle popolazioni attuali di Parma e delle province limitrofe (Reggio Emilia e Piacenza). L’acquisizione di dati genetici di popolazioni toscane, per alcune delle quali si suppone esista ancora un certo grado autoctonia, ha consentito di formulare stime della loro influenza sulla composizione degli attuali popolamenti transappenninici. Un’accurata documentazione bibliografica dalle principali fonti storiche, contenenti informazioni riguardo a ripopolamenti di capriolo in Italia nei decenni passati, ha confermato operazioni di reimmissione e traslocazione a partire dal secondo dopoguerra e ha messo in luce come episodi di traslocazione si verifichino ancora oggi a partire da popolazioni sviluppatesi da nuclei di individui provenienti da popolazioni slovene, croate, austriache, olandesi. L’analisi della variabilità mitocondriale è stata effettuata tramite sequenziamento diretto della regione di controllo (D-loop) e allineamento delle sequenze ottenute con altre presenti in banca dati per la costruzione di alberi filogenetici e Median-joining Network oppure tramite SSCP (Single-Strand Conformational Polymorphism) della prima regione ipervariabile della D-loop in 112 campioni provenienti da Parma, Piacenza, Reggio Emilia, Bologna, e da diverse province della Toscana. I risultati ottenuti mostrano che il 28% degli individui analizzati presenta aplotipi di popolazioni dell’Europa Centrale ed Orientale, mentre il 72% presenta aplotipi descritti in popolazioni della sottospecie Capreolus capreolus italicus. Anche i marcatori RAPD riflettono e confermano, parzialmente, la suddivisione tra i due aplotipi a livello nucleare. I marcatori STR supportano una moderata diversificazione tra popolazioni geografiche se si considerano a coppie, ma con una chiara evidenza di flusso genico in atto tra esse. I dati suggeriscono che l’attuale popolamento del territorio parmense e reggiano potrebbe derivare non solo da immissioni di individui alloctoni dalle Alpi e dall’Europa Orientale, ma anche da un apporto genetico di relitti autoctoni e da migranti dalla Toscana settentrionale. Il popolamento piacentino, a sua volta, raggruppa caratteristiche aplotipiche della popolazione ligure, storicamente reintrodotta con individui provenienti dall’Est Europa, ma anche di aplotipi riconducibili al clade italico, verosimilmente in espansione dalla provincia di Parma.

2. CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI LAMPREDE DI BACINI TIRRENICI E ADRIATICO DELL’ ITALIA CENTRALE Gli scopi del lavoro sono stati principalmente quelli di valutare la somiglianza genetica di popolazioni di Lampetra planeri residenti in bacini differenti (Adriatico e Tirreno) e verificare alcune ipotesi sull’origine della popolazione adriatica; inoltre, vista la difficoltà di identificazione delle specie Lampetra planeri, Petromyzon marinus e Lethenteron zanandreai, soprattutto a livello larvale, si è proceduto all’identificazione di marcatori molecolari utili per la diagnosi delle stesse, indipendentemente dallo stadio di sviluppo dei soggetti da classificare. A tal fine sono state eseguite la caratterizzazione aplotipica di tutti gli individui campionati, condotta attraverso l’analisi di sequenze parziali dei geni mitocondriali citocromo ossidasi I (COI) e citocromo B (Cyt b) (Barcoding molecolare), la costruzione di alberi filogenetici con metodi basati su distanze genetiche, l’analisi sperimentale del gene mitocondriale COI con RFLP e l’analisi multilocus con la tecnica RAPD tramite otto primer decanucleotidici. I risultati ottenuti hanno confermato la presenza di un unico aplotipo mitocondriale caratteristico di tutti i soggetti di L. planeri analizzati, che depone a favore di un recente isolamento riproduttivo non più sostenuto da specie sorelle migratrici. Inoltre, i marcatori RAPD indicano una modesta variabilità tra le popolazioni che può essere spiegata attraverso fenomeni di isolamento per distanza, supportato dalla scarsa vagilità degli individui della specie. È stato dimostrato, infine, che l’analisi dei polimorfismi di restrizione ottenuti impiegando amplificati del gene COI consente una rapida ed economica discriminazione delle specie, proponendosi, quindi, come valido strumento per migliorare le possibilità d’intervento a fini conservazionistici.

3. CARATTERIZZAZIONE APLOTIPICA DI DONNOLE (Mustela nivalis L.) ITALIANE L’obiettivo di tale studio era verificare le possibili origini biogeografiche e la strutturazione dell’attuale popolamento italiano ed insulare. A causa della grande variabilità che caratterizza la specie, della vastità dell’areale occupato e dell’incertezza riguardo alla collocazione dei rifugi glaciali pleistocenici, la sistematica e la filogeografia della donnola risultano ancora piuttosto incerte. Inoltre, la sua attuale presenza in alcune isole del Mediterraneo, quali la Sardegna, potrebbe essere spiegata attraverso introduzioni effettuate dall’uomo a partire dall’Età del Bronzo, piuttosto che con colonizzazioni avvenute durante le fasi di regressione marina nei periodi glaciali, come testimonia l’assenza di fossili pre-pleistocenici e pleistocenici in questi luoghi. Il lavoro svolto è consistito nel sequenziamento delle prime 550 basi della regione 5’ della D-loop di individui di provenienza geografica diversa (comprese Sardegna e Corsica), seguito dal confronto delle sequenze sperimentali con sequenze disponibili in banca dati (GenBank) e dalla costruzione di alberi filogenetici e Median-joining Network. L’esito delle analisi condotte conferma la presenza, in Italia, di due linee filetiche conformi sia con un’espansione da un ipotetico rifugio glaciale collocato nel sud-ovest dell’Europa, sia con una colonizzazione più tardiva a partire dall’Europa Orientale, probabilmente supportata dall’intervento umano. È confermata, inoltre, l’eventualità di una colonizzazione della Corsica a partire da animali italiani, mentre la popolazione sarda appare essere decisamente più eterogenea, con contributi riconducibili ad aplogruppi mitocondriali tipici di regioni europee e mediterranee diverse. Per quanto riguarda il popolamento sardo di M. nivalis, pertanto, non è possibile avanzare l’ipotesi di una colonizzazione univoca, né dal punto di vista geografico e nemmeno da quello temporale.

In Italy the genetic studies of population and species are still inadequate, especially those related to the management of wildlife. It is particularly important to carry out surveys on microevolutionary processes of manageable populations because this knowledge could be a valid tool for wildlife management. In this study we have used mitochondrial and nuclear markers to investigate the degree of differentiation and the origin of populations of three Italian animal species: the roe deer (Capreolus capreolus), a game species that has been restocked and translocated without following conservational principles; the non-parasitic Italian lampreys (Lampetra planeri and Lethenteron zanandreai), which show a decrease of their genetic diversity due to habitat loss caused by river habitat perturbation; the weasel (Mustela nivalis), which shows an elusive behaviour and is poorly studied from a biomolecular point of view.

1. ORIGIN AND EVOLUTION OF ROE DEER POPULATIONS (Capreolus capreolus L.) OF NORTHERN APENNINES We studied mitochondrial (D-loop) and nuclear (RAPD and STR markers) variability in roe deer, in order to evaluate genetic structure and origin of Parma, Reggio Emilia and Piacenza roe deer populations. Moreover, we compared these informations with genetic data of Tuscan populations, some of which are considered to be autochthonous, in order to evaluate their influence on the composition of the current populations of Emilia. We carried out an accurate bibliographical documentation from the principal historical sources, containing informations about translocations of roe deer in Italy in the past decades. It confirmed the existence of not well documented operations which started from the beginning of the Second World War. Moreover, we found the existance of current translocations with individuals of populations arising from allochthonous individuals of Slovenia, Croatia, Austria, Holland. To test the mitochondrial variability, we sequenced the control region (D-loop) or carried out SSCP (Single-Strand Conformational Polymorphism) of the first hypervariable region of D-loop in 112 samples coming from Parma, Piacenza, Reggio Emilia, Bologna and many Tuscan provinces. The results highlight that 28% of individuals have mitochondrial haplotypes of Central and Eastern European populations, while 72% of individuals have mitochondrial haplotypes of Capreolus capreolus italicus subspecies. RAPD markers partially confirm this haplotypic subdivision, while STR markers show a moderate differentiation among geographic populations, even if a gene flow among them is evident. These data suggest that current populations of Parma and Reggio Emilia originate not only from allochthonous individuals coming from Alps and Oriental Europe, but also from a genetic contribution of autochtonous relics and from migrants from northern Tuscany. The population of Piacenza, shows an haplotypic contribution of the ligurian population, reintroduced in the past with individuals coming from Eastern Europe, but also haplotypes of individuals belonging to the italicus clade, most likely in expansion from the Parma province.

2. MOLECULAR CHARACTERIZATION OF LAMPREYS OF TYRRHENIAN AND ADRIATIC BASINS OF CENTRAL ITALY This work appraised the genetic similarity of populations of Lampetra planeri of different (Adriatic and Tyrrhenian) basins and verified some hypotheses on the origin of the adriatic population. Moreover, because of the difficulty of identification of Lampetra planeri, Petromyzon marinus and Lethenteron zanandreai, especially to a larval level, we identified useful molecular markers for their classification. The haplotypic characterization of sampled individuals was performed by analysing partial sequences of mitochondrial genes COI and Cyt b; then we carried out the experimental analysis of mitochondrial gene COI by means of RFLP analysis and a multilocus analysis with RAPD markers by means of eight decanucleotidic primers. The results confirmed the presence of only one mitochondrial haplotype for every subject of L. planeri analyzed, giving a real evidence for a recent reproductive isolation not sustained by migratory sisters species. Moreover, RAPD markers point out a limited variability among the populations, which can be explained with the isolation by distance, supported by individuals scarce vagility. Finally, we showed that RFLP analysis of COI gene allows a rapid and economic discrimination of the species and, for this reason, it can be a valid tool in a management with conservation purposes.

3. MITOCHONDRIAL CHARACTERIZATION OF ITALIAN WEASELS (Mustela nivalis L.) The study aimed to verify the possible biogeographic origin and structure of the current continental and insular populations of Italian weasels. The systematic and phylogeography of weasels are still rather uncertain because of the great variability of the species, the vastness of its distribution area and the uncertainty of its glacial refugia of Pleistocene. Moreover, its actual presence in some Mediterranean islands, as Sardinia, could be more explained with human introductions since the Bronze age, rather than with natural colonisations in the glacial periods, as testified by the absence of pleistocenic fossils in these places. We firstly sequenced the first 550 bases of the 5' region of the D-loop of individuals of different geographical origins (Sardinia and Corsica included). Than we compared the experimental sequences available in GenBank and finally we built phylogenetic trees and Median-joining Network. The results confirm the presence of two phyletic lines in Italy. The first one could reflect an expansion from a hypothetical glacial refugium situated in the Southwestern Europe; the second one could reveal colonisations from Oriental Europe, probably supported by human intervention. Thus, the colonization of Corsica actually began from Italian animals, whereas the Sardinian population appears to be more heterogeneous, with mitochondrial haplotypes typical of different European and Mediterranean regions. It is still not possible, therefore, to advance the hypothesis of an univocal temporal or geographical colonization of the Sardinia.