Biotecnologie genetico-molecolari applicare all'analisi di filiera

Abstract

Nel corso del periodo di dottorato sono state sviluppate metodologie molecolari per la tracciabilità alimentare applicabili alla filiera di trasformazione del pomodoro. Tale filiera è stata scelta in quanto il pomodoro è una coltura orticola che riveste notevole importanza a livello globale. Il pomodoro è la seconda coltura più consumata al mondo dopo la patata e la più popolare coltura da giardino. Le piante di pomodoro vengono cresciute in modo ubiquitario nella maggior parte del mondo. Nonostante l’elevata diffusione del pomodoro a livello mondiale questo alimento non è considerato ad alto valore nutrizionale, tuttavia un pomodoro medio fornisce il 47% della dose giornaliera di vitamina C, il 22% della dose giornaliera di vitamina A ma solo 25 calorie. Nella dieta delle popolazioni americane il pomodoro è la maggior fonte di vitamine, minerali e antiossidanti fenolici tra cui vanno ricordati gli antiossidanti licopenici che proteggono le cellule dai radicali all’ossigeno che sembrano essere legati all’insorgenza di cancro. (Foolad, 2007) Le metodologie molecolari basate sull’analisi del DNA consentono di effettuare analisi, per il controllo della qualità e della genuinità dei prodotti in tempi brevi e con risultati sensibili. Per questo motivo la prima problematica analizzata è stata la procedura di estrazione del DNA dalle matrici prese in esame (pomodoro fresco, passata di pomodoro, salsa di pomodoro, polpa di pomodoro a pezzi, pomodori pelati, concentrato di pomodoro e sugo all’arrabbiata), in modo da mettere a punto metodiche genomico-molecolari che possano essere applicate alla traccibilità degli alimenti. L’elevato livello di processamento dei campioni di interesse determina un importante effetto degradativo del DNA presente all’interno degli stessi, per questo si è reso necessario testare 7 diverse metodiche di estrazione di DNA. La valutazione del metodo che meglio si adatta alle caratteristiche delle matrici prese in considerazione è stata effettuata analizzando diversi parametri a cui è stato assegnato un peso secondo l’approccio matematico definito dalla “Fuzzy Logic” abbinato con gli “Expert Weigth”. Dopo aver identificato la metodica di estrazione più adatta è stato effettuato un test per determinare il livello di degradazione del DNA estratto da tutte le matrici processate. A questo scopo sono state identificate 7 coppie di primer in grado di fornire, a seguito di reazioni di amplificazione mediante la tecnica di PCR, frammenti di amplificazione di lunghezza differente di 100pb in un range tra le 90pb e le 700pb. In lavori precedenti (Hammer, 2008) era stato dimostrato che il frammento di maggior lunghezza amplificabile da matrici quali “passate di pomodoro” è di 506pb, per quanto riguarda le prove effettuate nel caso di questo lavoro sono stati ottenuti frammenti di lunghezza massima di 400pb per le matrici meno processate, mentre per quelle più lavorate, la lunghezza massima ottenibile è stata di 300pb. Un problema importante, relativo alla commercializzazione dei pomodori, è legato ad eventuali frodi nei confronti del consumatore dovute alla sostituzione di prodotti DOP (denominazione di origine protetta) e IGP (identificazione geografica protetta) con prodotti generici a basso costo. A tale scopo sono state scelte 20 cultivar di pomodoro da mensa e da industria. Il DNA estratto da queste cultivar è stato amplificato, in reazioni di amplificazione mediante PCR, con 12 coppie di primer per microsatelliti (SSR). Dopo elettroforesi capillare sono stati identificati profili allelici utilizzati per ottenere matrici di distanze con cui è stato costruito un albero filogenetoco (UPGMA) con il software WinBoot. Data l’elevata vicinanza genetica degli ibridi commerciali di pomodoro presi in esame si è ottenuta una distizione poco netta dei gruppi (cluster); è stato comunque possibile distinguere, con qualche eccezione, i pomodori da industria da quelli da insalata. Calcolando il P(ID) (probabilità di identità) è stato possibile individuare il numero minimo di SSR utilizzabili per distinguere una varietà tra quelle prese in considerazione se mischiata con altre con una probabilità di errore p<0,05% (per gli SSR presi in esame il numero minimo utilizzabile è quattro). È stato amplificato e caratterizzato con alcuni SSR il DNA estratto dalle matrici commerciali, in questo modo è stato possibile rilevare alleli in comune tra il DNA estratto dalle matrici “passate” e dalle cultivar; indicazione importante dell’applicabilità della metodologia alla tracciabilità dei prodotti provenisti dalla filiera commerciale del pomodoro. L’ultimo aspetto preso in considerazione in questo lavoro è stato studiare l’influenza dell’arsenico sullo sviluppo delle specie di pomodoro commerciali. L’arsenico può essere naturalmente presente nell’ambiente, ma le fonti maggiori di contaminazioni da tale elemento sono dovuto all’attività umana. Lavori precedenti hanno dimostrato come diverse piante di interesse agronomico, come fagiolo, riso e pomodoro, sono in grado di assumere l’arsenico presente nel terreno e trasferirlo alle parte edibili della pianta. L’ingestione di vegetali contaminati da arsenico è la maggiore in cui l’uomo entra in contatto con il metalloide, per questo si è reso necessario studiare i meccanismi di interazione tra arsenico e pomodoro. A tale scopo sono state effettuate prove di germinazione in vitro di 8 cultivar commercili a diverse concentrazioni di arsenito (As(III)) e arseniato (As(V)) in presenza e in assenza di silicio. Le stesse cultivar sono state fatte crescere in terriccio universale e, arrivate all’età di tre mesi, trattate con As(V) in presenza e assenza di silicio. Le varietà che sono riultate più interessanti, cioè quelle che hanno mostrato un comportamento definibile accumulatore o esclusore, quasi sempre più tolleranti, verranno testate tramite crescita in vitro. Tali dati potranno essere utilizzati come indicazione per la coltivazione di determinate varietà in regioni i cui terreni e acque per l’irrigazione sono contaminati da arsenico.