Colture cellulari di Artemisia annua L. per lo studio della via biosintetica e la produzione dell’antimalarico artemisinina

Abstract

La malaria è una malattia febbrile acuta diffusa dalla puntura della zanzara femmina del genere Anopheles. Per più di 350 anni questa malattia è stata trattata con chinino, ma nell’ultimo decennio è stato scoperto che il chinino, non ha più effetto su molti ceppi resistenti di P. falciparum. Oggi un trattamento alternativo, efficace e sicuro, contro la malaria è rappresentato dall’artemisinina, un sesquiterpene lattone estratto da una pianta medicinale cinese Artemisia annua L. L’Artemisia annua L. è una pianta aromatica erbacea annuale appartenente alla famiglia delle Asteracae. L’artemisinina è sequestrata nei tricomi ghiandolari che ricoprono in particolar modo la superficie di foglie e fiori. La concentrazione di artemisinina nella pianta è relativamente bassa da 0,1 a 1% del peso secco. La produzione di artemisinina è ancora notevolmente costosa, vista la scarsa quantità di molecola presente nella pianta ed il periodo piuttosto limitato della sua presenza nella pianta. Ecco perché sono numerosi i gruppi di ricerca il cui principale obiettivo è quello di aumentare il contenuto in planta di artemisinina oppure di produrla in colture in vitro o mediante ingegnerizzazione di microrganismi. Gli studi finora condotti, per definire la via biosintetica dell’artemisinina hanno permesso di individuare diversi enzimi e i relativi geni. Tuttavia alcuni passaggi restano ancora da chiarire. Le colture in vitro rappresentano un valido strumento per uno studio approfondito delle vie biosintetiche di metaboliti vegetali, perché permettono di operare in condizioni sperimentali ben definite e controllate. Lo scopo di questa tesi è stato quello di allestire diversi tipi di colture cellulari di Artemisia annua al fine di individuare il sistema più idoneo alla produzione in vitro di artemisinina e di indagare sulla regolazione della via biosintetica, valutando l’espressione dei geni noti in colture in sospensione di A. annua, sottoposte a differenti trattamenti. Sono state allestite diverse tipologie di colture in vitro di Artemisia annua L. (colture di calli, cellule in sospensione e piantine micropropagate). Per aumentare il contenuto di artemisinina le colture in sospensione sono state elicitate con metil jasmonato, una molecola che stimola il metabolismo secondario e miconazolo, un inibitore della sintesi degli steroli, la via competitiva dei sesquiterpeni. Inoltre, le cellule sono state trattate con elicitori biotici come l’estratto fungino di Penicillium verrucosum. Attraverso analisi HPLC si è potuto osservare che i trattamenti hanno stimolato in misura differenziale la produzione di artemisinina. Il trattamento con metil jasmonato ha indotto un aumento massimo di 2,4 volte del contenuto di artemisinina dopo 4 ore di trattamento. Nel trattamento con miconazolo si è raggiunto il livello più alto di artemisinina (1,6 volte) quando le cellule sono state trattate per 5 giorni alla concentrazione di 200 M. L’analisi dell’espressione genica, mediante Real Time PCR, ha permesso di studiare la regolazione di alcuni geni della via biosintetica dell’artemisinina. L’analisi dell’espressione in cellule in sospensione di Artemisia annua ha rivelato, un aumento dell’espressione dei geni CYP71AV1, CPR e Dbr2, codificanti rispettivamente per gli enzimi citocromo P450 monossigenasi, citocromo P450 reduttasi e aldeide artemisinica 11(13) reduttasi. In particolare si è evidenziato un aumento dell’espressione di CYP71AV1 di circa 7 volte, dopo 30 min di trattamento con metil jasmonato. Nelle cellule trattate con miconazolo 200 M si è evidenziato un forte aumento dell’espressione del gene Dbr2, e di CPR rispettivamente dopo 30 min e 4 ore di trattamento. In questo lavoro di tesi è stato inoltre messo a punto il protocollo di isolamento di protoplasti sia da cellule in sospensione sia da piantine micropropagate di Artemisia annua. I protoplasti sono stati trasformati transientemente. Un altro aspetto della ricerca è stato volto ad identificare geni codificanti fattori di trascrizione in grado di influenzare la biosintesi di artemisinina. In particolare la nostra attenzione è stata focalizzata sulla famiglia di fattori di trascrizione WRKY. È stato isolato un nuovo fattore WRKY in Artemisia annua denominato AaWRKY3. La sequenza di AaWRKY3 è stata utilizzata per creare un costrutto chimerico con tag fluorescente: WRKY:GFP, utilizzato per trasformare transientemente protoplasti di cellule in sospensione di A. annua. Il costrutto WRKY:GFP andava a localizzarsi specificamente nel nucleo, così come tutti i fattori di trascrizione.