Promiscuità enzimatica ed evoluzione molecolare:studio di una lattonasi da Sulfolobus solfataricus in grado di degradare agenti nervini

Abstract

Si definisce promiscuità catalitica la capacità di un enzima di catalizzare reazioni aggiuntive al ruolo principale, che possono essere più o meno chimicamente differenti tra loro. Questa definizione si riferisce sia alla possibilità di catalizzare la trasformazione di substrati di natura diversa che di utilizzare differenti meccanismi di reazione e/o diversi siti catalitici1,2. L'enorme importanza legata allo studio della promiscuità enzimatica è sostanzialmente duplice. Da un punto di vista “teorico” è connesso con il riconoscimento molecolare, e, a più ampio raggio, con la biochimica degli organismi viventi. Questo ha conseguenze considerevoli nell'ambito dell'evoluzione delle specie. Da un punto di vista “pratico”, invece, la comprensione della promiscuità può facilitare il progresso della ingegneria proteica sia per applicazioni biomediche che industriali. Ed è con questo duplice scopo che si colloca il progetto di ricerca del seguente lavoro che ha scelto come modello di studio un enzima proveniente da fonte ipertermofila la cui funzione principale è quella di idrolizzare carbossilesteri ciclici (lattoni) e la sua funzione ancillare è la capacità di degradare fosfotriesteri di natura sintetica di cui fanno parte tutta una serie di inibitori irreversibili dell'acetilcolinestari (AChE), l'enzima chiave del sistema nervoso centrale umano. L'enzima oggetto di studio proviene dal microorganismo ipertermofilo archaeon Sulfolobus solfataricus presente nell'area vulcanica della Solfatara di Napoli ed è stato denominato SsoPox3. Per omologia di sequenza primaria è stato collocato nella superfamiglia delle amidoidrolasi, e per le sue proprietà cinetiche nel gruppo delle Lattonasi Fosfotriesterasi-simili (PLLs)4. SsoPox, infatti, idrolizza principalmente lattoni, in particolare acilomoserina lattoni (AHSL) e, come capacità ancillare, organofosfato fosfotriesteri (OPs). Di questo tipo di composti chimici fanno parte tutta una serie di pesticidi sintetici (clorpirifos, paraoxon, diazinon, ecc.) e gas nervini (sarin, soman, VX) apparsi sul pianeta per la prima volta negli anni '505. Per questa ragione enzimi capaci di degradare questi substrati sintetici si ritengono di recente evoluzione. Altri membri della superfamiglia delle amidoidrolasi sono in grado di degradare organofosfati come il paraoxon6. Il migliore enzima attualmente noto capace di degradare tali substrati è la fosfotriesterasi pPTE dal microorganismo mesofilo Pseudomonas diminuta7. Tale enzima idrolizza il paraoxon con una efficienza prossima al limite di diffusione di substrato, risultando così 10,000 volte più attivo in termini di specificità (kcat/KM) rispetto all'omologo ipertermofilo. E' in questo contesto che si inserisce l'obiettivo di questo lavoro di tesi: evolvere l'attività promiscua della lattonasi di S.solfataricus così da convertirla in una specializzata fosfotriesterasi. Questo per il duplice scopo di comprendere i meccanismi catalitici in grado di garantire molteplici attività enzimatiche coesistenti, e di rispondere alle persistenti domande di ottimizzazione di sistemi di decontaminazione/detossificazione degli scarichi tossici di organofosfati. La scelta di questo enzima modello è strettamente correlata con la sua elevata stabilità strutturale dipendente dalla fonte da cui proviene, che lo rende un perfetto candidato per approcci di evoluzione molecolare in vitro 8. L'intrinseca stabilità strutturale di un enzima, infatti, è un presupposto di notevole rilevanza per la sua evoluzione in quanto lo rende capace di sopportare molteplici mutazioni senza comprometterne l'impalcatura strutturale. Una strategia di evoluzione diretta (facendo convergere approcci “razionali” e “casuali” di mutagenesi) ha portato, in seguito alla caratterizzazione di diverse varianti, al mutante singolo SsoPoxW263F che mostra incrementata attività e specificità contro il fosfotriestere paraoxon di 30 e 16 volte rispettivamente, rispetto all'enzima wt. Inoltre, è stata testata la stabilità strutturale in presenza di diversi agenti denaturanti fino a incubazioni di 40h a temperatura ambiente, e in nessun caso s'è registrato annullamento dell'attività degli enzimi termofili. Al contrario in presenza di SDS l'enzima wt e la sua variante W263F mostrano un incremento della specificità di substrato verso il paraoxon, essenzialmente ascrivibile, a 25°C, ad un incremento della affinità. In tal modo la presenza del SDS nella miscela di saggio comporta un incremento di attività rispetto all'enzima non modificato di 150 volte per la variante SsoPoxW263F. Questa interessante proprietà è stata sfruttata per l'allestimento di un test dove l'enzima mesofilico pPTE e il termofilico SsoPox sono stati sottoposti alle medesime condizioni di stress da solventi organici e surfattanti per avere la “prova di concetto” che l'attività promiscua di un enzima termostabile rappresenta un buon punto di partenza per lo sviluppo di un robusto e competitivo catalizzatore bio-compatibile. Un altro approccio di evoluzione molecolare è stato utilizzato al fine di produrre un ibrido tra SsoPox e pPTE. Delle 14 mutazioni disegnate ed ottenute, per ricombinazione con l'enzima non modificato, una variante tripla contenente anche la mutazione nella posizione W263, risultava in un incremento significativo della costante catalitica (130 volte). Questo risultato conferma che quella posizione ha un ruolo chiave per l'attività idrolitica nei confronti del paraoxon. Inoltre è stata valutata la variazione dell'attività lattonasica nelle varianti ottenute con incrementata attività fosfotriesterasica. Ciò che è risultato interessante è che mentre si osserva un parallelo incremento dell'attività lattonasica verso il lattone sintetico Tiobutil--butirrolattone (TBBL), l'attività verso acilomoserina lattoni naturali risulta diminuita se non addirittura annullata, nel caso della variante tripla. Uno studio di simulazione di legame condotto su Silicon Grafics ha messo in evidenza la presenza di un'altra tasca di legame in cui si accomoderebbe il substrato TBBL. Questa tasca risulta distinta da quella identificata per il legame con un analogo di substrato tipo omocisteina lattone (C10HTL) ottenuto nella struttura di SsoPox risolta, in presenza e in assenza di questo analogo, durante questo lavoro di tesi grazie alla collaborazione con il gruppo del prof. E. Chabriere dell'Università di Marseille (Francia)9, 10. La conoscenza della struttura dell'enzima, degli effetti sulle attività enzimatiche principali e promiscue su tutta una serie di varianti dell'enzima qui ottenuti, ha permesso infine di formulare un'ipotesi sul differente meccanismo d'azione di SsoPox verso i due tipi di substrati: fosfotriesteri e lattoni.

Referenze 1 O'Brien PJ, Herschlag D. Chemistry and Biology 1999; 6:R91-R105. 2 Bornscheuer UT, Kazlauskas RJ. Angew Chem Int Ed Engl. 2004; 43:6032-40. 3 Merone L, Mandrich L, Rossi M, Manco G. Extremophiles 2005; 9:297-305. 4 Afriat L, Roodveldt C, Manco G, Tawfik DS. Biochemistry 2006; 45:13677-86 5 Schrader G. Angew. Chem. 1950; 62: 471–3. 6 Roodvelt C, Tawfik DS. Biochemistry 2005; 44:12728-36. 7 Dumas DP, Caldwell SR, Wild JR, Raushel FM. J Biol Chem 1989; 264:9659-66. 8 Bloom JD, Labthavikul ST, Otey CR, Arnold FH. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2006; 103:5869-5874. 9 Elias M, Dupuy J, Merone L, et al. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2007 63:553-5. 10 Elias M, Dupuy J, Merone L, et al. J Mol Biol. 2008 379:1017-28.