Caratterizzazione biochimica, biofisica e strutturale di proteine di batteriofagi infettanti Lactococcus lactis coinvolte in meccanismi di Ricombinazione Omologa e Infezione Abortiva Antivirale

Abstract

I batteriofagi virulenti del gruppo 936 e P335 sono predominanti nelle infezioni verso Lactococcus lactis, un batterio Gram-positivo molto diffuso nell’industria casearia. Tra i meccanismi adottati dal batterio contro l’infezione virale, ritroviamo i meccanismi abortivi antivirali (Abi), di cui poco si conosce riguardo alla loro modalità d’azione. Sotto la pressione selettiva dei sistemi Abi, la ricombinazione omologa con sequenze presenti nel cromosoma batterico (Bouchard et al 2000 et 2002, Moineau et al 1995) produce fagi mutati che sono stati ritrovati in fermentazioni ad esito negativo e perciò recanti enormi perdite economiche. Riguardo il sistema AbiK, Bouchard et al (Bouchard et al 2004) hanno identificato quattro proteine denominate Sak, a bassa similarità di sequenza, ma tutte implicate nella sensibilità verso AbiK. Tra queste proteine, Ploquin et al (Ploquin et al 2008) hanno dimostrato che la ORF252 del fago ul36 (specie P335), denominata Sak, é una “DNA Single Strand Annealing Protein (SSAP)“, omologa della proteina eucariotica RAD52. Sak3 del fago p2 (specie 936) é invece la proteina di riferimento del terzo gruppo di geni sak che non mostrano alcuna similarità di sequenza con le SSAPs. Indipendentemente da questo, le proteine Sak sono sicuramente coinvolte nel meccanismo di ricombinazione omologa poiché i loro geni sono localizzati in « recombination cassette » insieme a geni di altre proteine chiaramente implicate in questi meccanismi (Bouchard and Moineau, 2004). La prima parte dei nostri studi é stata focalizzata sulla caratterizzazione biochimica e strutturale delle due proteine Sak : Sak del fago UL36 e Sak3 del fago p2. Di queste ultime abbiamo studiato lo stato di oligomerizzazione attraverso un approccio multi-tecnica, abbiamo visualizzato le tipiche strutture ad anello (Cryo Microscopie Electronique) ed allestito test funzionali per chiarire la loro appartenenza alla famiglia delle SSAP. La loro capacità di legare il DNA é stata inoltre testata e studiata attraverso « Electrophoretic Mobility Shift Assays, EMSA », Microscopia a Forza Atomica (AFM) e « Surface Plasmon Resonance, SPR » ; la relazione con altri partners nel processo di ricombinazione omologa é stata inoltre testata tramite SPR. Nella seconda parte del nostro studio, abbiamo caratterizzato la “Single-Strand Binding protein (SSB)” del fago p2, partner di Sak3 nella ricombinazione omologa. A questo proposito sono stati studiati il livello di espressione di SSB durante l’infezione fagica, la sua capacità di legare il DNA a singolo filamento, le sue implicazioni nel meccanismo di ricombinazione omologa ed abbiamo determinato la sua struttura tridimensionale. I nostri risultati costituiscono gli elementi che permetteranno la comprensione di alcune funzioni sconosciute delle proteine Sak, in particolare del legame tra gli avvenimenti del processamento del DNA ed il sistema AbiK, dell’implicazione di altre proteine correlate come le SSBs in questi meccanismi.

Virulent phages of the 936 and P335 group are predominant in infections to Lactococcus lactis, a Gram-positive bacterium widely used in the dairy industry. Among the mechanisms adopted by the bacterium against virus infection, abortive infection mechanisms (Abi) were found, but little is known about their molecular way of action. Under the selective pressure of Abi systems, homologous recombination with phage-related sequences present in the host chromosome (Bouchard et al 2000 and 2002, Moineau et al 1995) produces phage mutants which are found in unsuccessful fermentations that lead to huge economical looses. In particular for the AbiK system, Bouchard et al (Bouchard et al 2004) have identified four non similar proteins involved in the sensibility to AbiK named Sak. Among these proteins, Ploquin et al (Ploquin et al 2008) demonstrated that ORF252 of phage ul36 (species P335), renamed Sak, is a DNA Single-Strand Annealing Protein (SSAP), homologue of the eukaryotic protein RAD52. Sak3 from phage p2 (species 936) is reported to be the reference for the third group of identified sak genes that do not show significant sequence similatity to SSAPs. However, Sak proteins were suspected to be involved in homologous recombination due to their genetic localization in “recombination cassette” with other genes of proteins clearly involved in these processes (Bouchard and Moineau, 2004).The first part of our studies present the biochemical and structural characterization of two Sak proteins: the Sak of phage UL36 and the Sak3 of phage p2. In particular, multi-technique approaches were performed to investigate the oligomerization state and to visualise ring structures (Cryo Electron Microscopy), while functional tests were used to elucidate the SSAP family membership. DNA binding properties were also tested by gel mobility shift assays (EMSA), atomic force microscopy (AFM) and surface plasmon resonance (SPR), and the relationship with their partners in homologous recombination was determined. In the second part of our studies the phage p2 single-strand binding protein (SSB), a Sak3 partner in homologous recombination/replication, was studied. Expression level during phage infection, binding properties to ssDNA, involvement in homologous recombination processes and tridimensional structure were elucidated. Our studies might complete and help to understand some aspects of the Sak function leading to the definition of a linkage between DNA processing events and the antiviral system AbiK, and might elucidate the implication of correlated recombinant proteins like SSBs in these processes.