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dc.contributor.advisorBussolati, Ovidio-
dc.contributor.authorBianchi, Massimiliano-
dc.date.accessioned2009-06-26T07:35:48Z-
dc.date.available2009-06-26T07:35:48Z-
dc.date.issued2009-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/1889/1100-
dc.description.abstractQuesto lavoro di tesi, è stato dedicato allo studio di alcuni nuovi meccanismi di regolazione del trasportatore per il glutammato EAAC1, la controparte murina del carrier EAAT3 umano. In particolare è stato dimostrato che in cellule C6 di glioma di ratto l’attività del trasportatore EAAC1 dipende dall’integrità del citoscheletro actinico. Sia la Latrunculina A che la Citocalasina D, due tossine in grado di depolimerizzare i microfilamenti actinici, causavano infatti una sensibile riduzione dell’attività del trasportatore EAAC1 diminuendo la sua espressione di membrana. Tuttavia, anche dopo il trattamento con le due tossine, era osservabile la stimolazione del trasporto di aspartato EAAC1 causatoa dall’attivazione di PKC. In aggiunta, è stato dimostrato successivamente che il trafficking di EAAC1 era dipendente anche dalla componente microtubulare, dato che la Colchicina inibiva sensibilmente l’influsso di aspartato mediato dal carrier. Questa prima serie di risultati hanno dimostrato che EAAC1 interagisce sia con i microfilamenti di actina che con i microtubuli e hanno suggerito l’esistenza di diversi pools intracellulare del trasportatore. Sono stati recentemente identificati diversi partner molecolari di EAAC1 capaci di influenzarne sia l’attività di trasporto che il traffico di membrana. Abbiamo quindi ipotizzato l’esistenza di componenti proteine legate al citoscheletro come possibili partner del trasportatore. La nostra attenzione è stata rivolta verso l’adducina, una actin-binding protein recentemente scoperta essere associata a diversi carriers e coinvolta nel loro traffico intracellulare. Grazie ad esperimenti di microscopia confocale, abbiamo osservato l’esistenza di specifiche aree di colocalizzazione perinucleare tra EAAC1 e adducina sia prima che dopo attivazione di PKC. Queste evidenze sono state successivamente confermate da approcci biochimici di coimmuno precipitazione, dimostrando l’effettiva esistenza di una interazione PKC-indipendente tra alcuni pools di EAAC1 e adducina. La specificità di questo legame è stata dimostrata applicando i medesimi approcci sperimentali su cellule C6 esprimenti adducina marcata in emoagglutinina (HA), ottenute mediante transfezione stabile. Al fine di studiare più dettagliatamente la natura di questa interazione, abbiamo tentato di identificare condizioni sperimentali che fossero capaci di modificare l’espressione del trasportatore. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il trattamento cronico delle cellule C6 con acido all-trans retinico (ATRA) induceva un sostanziale aumento sia dell’espressione della proteina EAAC1 che del proprio gene codificante Slc1a1. In cellule sovra esprimenti il trasportatore, la quantità di adducina coimmunoprecipitata con esso era sensibilmente aumentata rispetto alla quota osservata in cellule non trattate con ATRA. Questi risultati hanno dimostrato quindi che l’adducina è un effettivo partner molecolare del trasportatore EAAC1. Di particolare rilevanza biologica è in oltre l’effetto mediato da ATRA sull’espressione di EAAC1, visto che dati di letteratura riguardanti la sua regolazione a livello genico sono ancora scarsi. Studiando più dettagliatamente questo fenomeno, abbiamo osservato che il trattamento cronico con ATRA aumentava di quattro volte l’attività del trasporto di aminoacidi anionici in cellule C6, dovuto ad un aumento di espressione della proteina EAAC1. Mentre l’RT-qPCR dimostrava un proporzionale aumento di espressione del gene Slc1a1, l’immunofluorescenza mostrava un profondo cambiamento morfologico delle cellule C6 trattate con ATRA, suggerendo che l’induzione di Slc1a1 poteva essere uno step di un processo differenziativo. Questa ipotesi era supportata dall’induzione di Plp, un tipico marker di differenziamento oligodendrocitario, nelle medesime condizioni sperimentali nelle quali Slc1a1 era stimolato, mentre Gfap e Tubulina beta 3, due markers di differenziamento, rispettivamente astrogliale e neuronale, erano down-regolati. Abbiamo quindi documentato per la prima volta l’induzione di EAAC1 mediante l’utilizzo di un agente differenziante e come l’espressione del trasportatore possa essere considerata un marker di differenziamento oligodendrocitario. Recenti sviluppi di questo studio sono stati finalizzati a confermare gli effetti di ATRA in modelli cellulari ex vivo sia di precursori oligodendrocitari che di oligodendrociti maturi. Sono stati studiati i meccanismi molecolari sottostanti agli effetti di ATRA, dimostrando che la stimolazione dell’attività del trasportatore EAAC1 indotta da ATRA era mediata da recettori per l’acido retinoico RAR. Infatti, mentre uno specifico agonista per i recettori RAR mimava totalmente gli effetti di ATRA, l’agonista dei recettori RXR non influenzava l’attività del trasportatore EAAC1. Al contrario, un inibitore specifico per i RAR sopprimeva la stimolazione ATRA-dipendente di EAAC1 mentre l’inibitore selettivo per RXR non era in grado di contrastare l’effetto mediato dal retinoide. Abbiamo in oltre osservato che l’induzione mediata da ATRA di EAAC1 dipende dalla neosintesi di un intermedio proteico e non da un aumento dell’emivita del messaggero di Slc1a1. E’ noto che l’ATRA induce l’espressione di RARβ in diversi modelli cellulari sia a livello di mRNA che di proteina. Anche nelle nostre condizioni sperimentali ATRA causava l’induzione di questo recettore e abbiamo quindi ipotizzato che la stimolazione di Slc1a1 richieda l’espressione ATRA-dipendente del recettore. Significativo è il dato derivante da esperimenti di silenziamento genico per RARβ in cui si osservava una forte inibizione dell’espressione di Slc1a1 così come quella di RARβ dopo trattamento con ATRA. Questi risultati suggeriscono che Slc1a1 sia un gene target di RARβ.en
dc.description.abstractIn this thesis work, novel regulatory features of the glutamate transporter EAAC1, the murine counterpart of the human carrier EAAT3, have been studied. In particular, it has been demonstrated that in rat glioma C6 cells the transport activity of EAAC1 is dependent from the integrity of actin cytoskeleton. Both Latrunculin A and Cytochalasin D, two actin cytoskeleton disrupting agents, lowered the transport activity of EAAC1 decreasing its membrane abundance. However, the stimulation of EAAC1 transport activity observed after PKC-activation, was still detectable after the disruption of actin filaments. In the same study, I also observed that EAAC1 membrane trafficking was sensitive to the disorganization of microtubules, since Colchicine inhibited the aspartate influx mediated by the carrier. Altogether, these results indicated that EAAC1 interacts with both actin microfilaments and microtubules and suggested the existence of several EAAC1 intracellular pools. Recently, several EAAC1 molecular partners have been identified that regulate either transporter trafficking or its transport activity. We have, therefore, hypothesized that also cytoskeletal components may interact with the transporter. Our attention focussed on an actin binding protein called adducin, previously found associated to other carriers and involved in their trafficking. Consistently with this hypothesis, confocal images showed areas of colocalization between an intracellular EAAC1 pool, localized in the perinuclear region, and α-adducin either before or after PKC-activation. Immunocytochemical evidence was supported by co-immunoprecipitation experiments that demonstrated the existence of a PKC-independent interaction between a pool of EAAC1 carriers and adducin. The interaction between EAAC1 and adducin was also confirmed in lysates of C6 cells transfected with α-adducin linked to a hemagglutinin (HA) epitope and immunoprecipitated with an anti-HA antibody. To investigate more in depth the interaction between EAAC1 and adducin, we have attempted to identify experimental conditions able to increase the expression of the transporter. We found that all-trans retinoic acid (ATRA) induced a substantial overexpression of Slc1a1 and EAAC1. Moreover, in lysates of ATRA-treated cells we observed that the amount of adducin co-immunoprcipitated with EAAC1 was strongly augmented compared with lysates of untreated cells. These data confirm that adducin is a partner of the EAAC1 transporter. The EAAC1 overexpression induced by ATRA was per se a biologically significant finding and we decided to characterize the phenomenon . The results obtained indicated that the chronic treatment with ATRA caused a four-fold increase of transport activity for anionic amino acids in C6 cells due to the overexpression of the EAAC1 protein. A proportional increase in Slc1a1 mRNA was observed with RT-qPCR while immunofluorescence showed a huge change in cell morphology after ATRA treatement suggesting that Slc1a1 induction may be a step in a differentiation process. This possibility was supported by the induction of Plp, a typical oligodendrocytic marker, under the same conditions in which Slc1a1 expression is stimulated, while Gfap and Tubulin beta 3, two markers of, respectively, astroglial and neurones, were down regulated. Thus, we documented for the first time the induction of EAAC1 with a differentiating agent and proposed that the expression of the transporter may represent a marker of oligodendrocytic differentiation pathway. Recent developments of this study have been aimed to confirm ATRA effects in ex-vivo models consisting of oligodendrocytes and oligodendrocytic precursor cells. The molecular mechanisms underlying ATRA effects have been also investigated in C6 cells. The stimulation of EAAC1 transport activity after ATRA treatment was found dependent on the Retinoic Acid Receptors (RAR), since a specific RAR agonist fully mimicked ATRA effect while a specific agonist of Retinoic X Receptors (RXR) did not stimulate EAAC1 transport activity when used alone. Moreover, a RAR-specific, but not a RXR-specific, inhibitor suppressed ATRA-dependent stimulation. We also observed that ATRA effect required the synthesis of a protein intermediate and did not involve changes of the Slc1a1 mRNA half-life. Since it is known that ATRA treatment causes RARβ induction, we hypothesized that the stimulation of Slc1a1 expression requires the ATRA-mediated expression of the receptor. Indeed, we found that ATRA caused an early RARβ induction at either mRNA and protein level. More importantly, RARβ(1-2) silencing strongly inhibited Slc1a1 as well as RARβ induction by ATRA. These results point to Slc1a1 as a RARβ target gene.en
dc.language.isoIngleseen
dc.publisherUniversità degli Studi di Parma, Dipartimento di Medicina Sperimentaleen
dc.relation.ispartofseriesDottorato di ricerca in Biologia e patologia molecolareen
dc.rights© Massimiliano Bianchi, 2009en
dc.subjectGlutamate transporten
dc.subjectExcitoxicityen
dc.subjectEAAC1en
dc.subjectSlc1a1en
dc.subjectCytoskeletonen
dc.subjectPKC, PDBuen
dc.subjectLatrunculin Aen
dc.subjectCytochalasin Den
dc.subjectAdducinen
dc.subjectATRAen
dc.subjectDifferentiationen
dc.subjectRARβen
dc.subjectRXRen
dc.titleNovel insights on the regulation of the EAAT3/EAAC1 glutamate transporter : interactions with the actin cytoskeleton and induction by retinoic aciden
dc.title.alternativeNuovi aspetti regolativi del trasportatore per il glutamato EAAT3/EAAC1 : interazioni con il citoscheletro actinico e induzione da acido retinoicoen
dc.typeDoctoral thesisen
dc.subject.miurMED/04en
dc.description.fulltextopenen
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