Il contributo delle biotecnologie alla "carta di identità" dell'olio di oliva

Abstract

Lo sviluppo di sistemi di tracciabilità molecolare per ricostruire attraverso la filiera la storia produttiva di un alimento hanno ormai assunto una funzione importante nel garantire l’origine e la sicurezza dei prodotti alimentari. La tracciabilità attraverso analisi molecolari costituisce un vantaggio rispetto al sistema attuale basato prevalentemente sull’uso di documentazione cartacea ed è un valido strumento in appoggio alle tecniche analitiche classiche. Lo scopo di questa tesi è stato quello di sviluppare e implementare metodologie genetiche e molecolari per la tracciabilità dei prodotti alimentari, prendendo come caso di studio l’olio di oliva. L’olivo (Olea europaea L.) è una delle piante più importanti per la produzione di olio nell’area del Mediterraneo. La sua coltivazione è in forte espansione e la richiesta dei prodotti da esso derivati è in significativo aumento, dato il loro utilizzo nelle diete alimentari grazie agli effetti benefici da esso dimostrati per la salute umana. La tutela della autenticità di origine di questo prodotto è quindi ormai una concreta esigenza, recepita anche dalla Unione Europea che ha istituito i marchi DOP (Denominazione di Origine Protetta) e IGP (Indicazione Geografica Protetta) per proteggere gli oli di maggior pregio. Come tutti i prodotti di un certo valore anche l’olio di oliva può essere soggetto a frodi ed adulterazioni, ad esempio l’addizione di oli ottenuti da specie diverse dall’olivo o da cultivar di scarso pregio. L’analisi dei residui di DNA contenuti nell’olio di oliva può quindi consentire di individuare le cultivar di olivo di origine presenti o l’addizione di eventuali oli provenienti da altre specie. La prima fase per svolgere un’analisi molecolare del DNA contenuto nell’olio è lo sviluppo e l’ottimizzazione di un metodo estrattivo. Un metodo commerciale, basato sull’uso di un kit e uno sperimentale sviluppato in laboratorio sono stati comparati per valutare l’effetto matrice dell’olio sulla resa estrattiva, il livello di purificazione del DNA, la quantità di campione iniziale per avere una resa adeguata di DNA, l’eventuale presenza di inibitori nell’estratto, i costi e i tempi di estrazione. Metodi di estrazione del DNA sono stati applicati anche a oli di semi comunemente utilizzati per le sofisticazioni al fine di verificarne la presenza nell’olio di oliva. L’analisi ha portato alla individuazione di un metodo di estrazione efficiente per il recupero del DNA sia dall’olio di oliva che dall’olio di semi. Amplificazioni con primer disegnati per produrre ampliconi di diversa grandezza hanno evidenziato che dimensioni inferiori alle 100 bp consentono di amplificare con successo il DNA bersaglio in estrazioni da olio di oliva e di semi. Una volta sviluppato e validato il metodo di estrazione, il lavoro è stato articolato in due filoni di ricerca: i) sviluppo di metodi per identificare le adulterazioni con oli di specie diverse dall’olio di oliva; ii) sviluppo di metodiche basate sull’uso marcatori molecolari per stabilire la composizione varietale di oli di oliva pregiati. Attraverso la tecnica della Real-Time PCR, l’analisi dei profili di dissociazione degli ampliconi ha consentito l’identificazione di tracce di DNA di nocciola, mais e girasole in miscele di olio di oliva. L’analisi ha portato alla individuazione di temperature di dissociazione caratteristiche per gli ampliconi derivanti dai tre oli di interesse, sia in PCR singola che duplex. L’efficienza di amplificazione delle reazioni sviluppate è risultata compresa tra 89.91% e 97.04% con un limite di rivelazione di 6.25 ng di DNA bersaglio. La seconda parte del lavoro di ricerca svolto è stata mirata allo sviluppo di metodologie per determinare la composizione varietale di un olio utilizzando marcatori molecolari microsatelliti. Undici microsatelliti, nove nucleari e due cloroplastici, sono stati utilizzati per analizzare 21 oli di oliva monovarietali. Sono stati valutati diversi parametri: l’amplificabilità in PCR, la corrispondenza allelica con la foglia di olivo della cultivar di origine dell’olio e la riproducibilità dei profili microsatelliti in diverse estrazioni di olio. L’affidabilità dei profili SSR (Simple Sequence Repeat) dell’olio d’oliva può essere stabilita solo nell’analisi di più estrazioni di DNA indipendenti dallo stesso campione. L’olio di oliva contiene, infatti, un ampio numero di inibitori di PCR, che potenzialmente possono portare a profili artefatti e non affidabili. I risultati hanno mostrato che la corrispondenza tra profili degli oli e quelli delle piante di origine sul totale delle repliche di PCR eseguite era vicina al 32% e che l’estrazione di DNA dall’olio d’oliva era il passaggio limitante per l’affidabilità dei profili SSR dovuta alla complessità della matrice analizzata. La riproducibilità di un profilo SSR con tre diverse estrazioni oscilla tra il 70% e il 30% e dipende dal tipo di microsatellite usato. Gli stessi parametri dipendono fortemente anche dal tipo di olio di oliva analizzato: l’amplificabilità varia dal 76% al 12%, mentre la corrispondenza con la foglia della cultivar di origine varia dal 72% al 2%. Questo significa che la diversa composizione chimica degli oli può influire sulla qualità del DNA estratto e quindi sulla successiva amplificazione in PCR. I microsatelliti cloroplastici presentano un’efficienza sia in termini di amplificabilità che di corrispondenza con la cultivar di origine dell’olio nettamente più alta rispetto a quella dei marcatori nucleari. I valori percentuali sia di amplificabilità che di corrispondenza totale sono rispettivamente del 64% e del 69% per i due marcatori testati. La riproducibilità si attesta oltre il 60%. Poiché il DNA nell’olio di oliva è degradato, per migliorare l’efficienza dell’analisi molecolare si è cercato di ridurre le dimensioni degli ampliconi relativi ai microsatelliti. Sono state perciò ridisegnate nuove coppie di primer più vicine alla ripetizione microsatellitare riducendo le dimensioni dell’amplicone. Questi nuovi primer hanno portato ad un certo miglioramento dell’amplificabilità e della corrispondenza totale con la cultivar di origine dell’olio. Nell’ultima parte del lavoro è stata valutata la possibilità di utilizzare la Real-Time PCR per quantificare le cultivar di olivo presenti in miscele di olio. A questo scopo è stato preso in considerazione un marcatore SNP (Single Nucleotide Polymorphism) identificato all’interno della sequenza del gene per l’oleosina su cui sono state disegnate due sonde TaqMan-MGB specifiche per le due varianti alleliche. Dopo l’ottimizzazione della reazione e le prove su miscele di DNA estratto da foglia di olivo, le analisi sono state condotte su miscele di oli prodotti dalle cultivar con le due varianti alleliche del polimorfismo SNP. Le reazioni condotte in duplex, hanno mostrato come le amplificazioni fossero specifiche per i singoli genotipi ma che l’amplificazione del DNA non corrispondeva alle quantità relative delle cultivar nelle miscele di olio.

The development of molecular systems for traceability to investigate the history of a food production has been a very important step to guarantee the origin and safety of food. Traceability through molecular analysis is an advantage compared to the current system based mainly on the use of paper information and it is be a tool supporting the traditional analytical techniques. The aim of this work has been the development and implementation of genetic and molecular methodologies for tracing foodstuffs, taking as a case study the olive oil. The olive (Olea europaea L.) is one of the most important plants for the oil production in the Mediterranean basin. Its cultivation is booming and the demand for olive oil is significantly increasing, due to its use in diets because of thanks to the positive effects on human health. Therefore the protection of the authenticity of origin of this food is now a practical need, supported also by the European Union which has established brands as PDO (Protected Designation of Origin) and PGI (Protected Geographical Indication) to guarantee the olive oil productions. As all the products of great value, olive oil may be subject to frauds and adulterations, such as the addition of oils obtained from other species or from olive cultivars of little value. The analysis of DNA residues in olive oil can be a new tool to identify the origin of olive cultivars and for the detection of oils from other species. The first step to perform molecular analysis of DNA in olive oil is the development and optimization of the extraction method. One method based on an commercial kit and one protocol developed in laboratory were compared to assess their efficiency in terms of yield, DNA purity, volume of oil required for a DNA optimal yield, costs and quickness of each extraction. DNA extraction methods were also applied to seed oils commonly used for adulteration. The analysis led to the identification of an extraction method for an efficient recovery of DNA both from olive oil and seeds oil. Amplifications carried out with primers designed to produce different size amplicons have shown that amplicons smaller than 100 bp allow a successful DNA amplification in olive oil and seeds oils extractions. After development and evaluation of DNA extraction method, the work was divided into two research lines : i) development of methods to identify adulterations with different origin non olive oils; ii) development of molecular markers methods for the identification of olive oils cultivars present in an oil. The analysis of dissociation profiles of amplicons by Real-Time PCR, has allowed the identification of DNA traces of hazelnut, maize and sunflower in mixtures made with different percentages of these oils. The detection of amplicons, for the three species mentionated above, was carried out successfully both in end point and Real-Time PCR, singolplex and duplex. The PCR efficiency has been between 89.91% and 97.04%, with a limit of detection of 6.25 ng of DNA target. The second step of the research work was the development of methods to determine the varietal composition of oil using Simple Sequence Repeat markers (SSRs or microsatellites). DNA extracted from twenty-one monovarietal olive oils produced from sixteen olive cultivars were analyzed by nine nuclear and two chloroplastic microsatellite markers. For each marker, the amplificability of DNA, the allelic correspondence of SSR profiles with reference leaves and the reproducibility in different DNA extractions were estimated. The reliability of olive oil SSR profiles can be assessed conducting several independent DNA extractions from the same sample, this is needed because a great number of PCR inhibitors were present in olive oil, which can potentially lead to artifact and unreliable profiles. The results showed that the correspondence between profiles of oils and reference leaf cultivar was close to the 32% of the number of experiments conducted and the olive oil DNA extraction was the limiting step for reliability of SSR profiles. The reproducibility of a SSR profile with three different extractions ranged between 70% and 30% and it depends on microsatellite markers. The same parameters heavily depend on the type of olive oil: the amplificability ranges from 76% to 12% while the matches with the origin leaf cultivars varies from 72% to 2%. This means that the different chemical composition of the oil can affect the quality of DNA extracted and the PCR amplificability. Chloroplastic microsatellites showed an efficiency, both in terms of amplificability and of correspondence with the reference cultivar leaves, that is much higher than that of nuclear markers. The percentages both of amplificability and total correspondence were respectively 64% and 69% for the two markers tested. The reproducibility was over 60%. As DNA in olive oil is highly degraded, to improve the efficiency of molecular markers we tried to reduce the size of amplicons for the microsatellites. To reduce the amplicon size, new primers have been redesigned closer to the microsatellite region. The last part of this work was devoted to asses the possibility to quantify through Real-Time PCR analysis the olive cultivars present in a multivarietal olive oil. For this purpose, the sequence of the gene oleosine, in which a SNP (Single Nucleotide Polymorphism) was detected, was used as target. Two TaqMan-MGB probes specific for SNP variants were designed and tested on an olive oil blend produced with cultivars carrying the two allelic variants. The reactions carried out in duplex, showed that the probes were specific for the genotypes but that the amplification of DNA does not match the amount of the cultivars in the oil blending.