Identification and transcriptional regulation of eukaryotic small nuclear RNA genes

Abstract

L’attività di ricerca descritta in questo lavoro di tesi riguarda la regolazione trascrizionale di geni codificanti per small nuclear RNA (snRNAs), un gruppo di trascritti abbondanti, non codificanti proteine, che formano il cuore dello spliceosoma, deputato alla rimozione di introni dai pre-RNA messaggeri. Gli snRNA (U1-U6) sono sintetizzati dalla RNA Polimerasi (Pol) II, tranne lo snRNA U6, il cui gene è trascritto dalla RNA Polimerasi III. Rispetto agli snRNAs nei metazoi, si conosce poco della sintesi degli snRNA negli organismi unicellulari. Nel primo lavoro descritto in questa tesi abbiamo identificato putativi elementi regolatori nei promotori dei geni di lievito trascritti dalla Polimerasi II attraverso un “footprinting filogenetico”. L’analisi ha identificato alcuni blocchi conservati di sequenze corrispondenti ai consensi dei siti di legami per “general regulatory factors” (Rap1, Abf1, Reb1) ed alcuni elementi regolatori coinvolti in differenti pathways metabolici (RRPE - ribosomal RNA processing element; PACE - Proteasome Associated Control Element). Per capire più a fondo il coinvolgimento nella trascrizione dei putativi elementi regolatori così identificati, abbiamo preparato versioni marcate di due geni di S. cerevisiae codificanti per snRNA, LRS1 (codificante per U2 snRNA) e SNR7 (codificante per U5 snRNA), da utilizzare come geni reporter per analisi di espressione in vivo. L’analisi mutazionale degli elementi conservati nella regione a monte dell’inizio della trascrizione, ha rivelato la loro effettiva influenza nella trascrizione, probabilmente attraverso la creazione o il mantenimento di una regione libera da nucleosomi. La seconda parte di questa tesi si è focalizzata sulla caratterizzazione di nuove unità trascrizionali “tipo snRNA” nel genoma umano. Attraverso una ricerca computazionale per elementi tipici dei promotori dei geni per snRNAs (proximal sequence element and distal sequence element), abbiamo identificato alcune putative unità trascrizionali. Abbiamo analizzato le proprietà di trascrizione in vitro di alcune di queste unità in estratti nucleari da linee cellulari HeLa e SKNBE, mostrando come gli elementi promotori fossero effettivamente in grado di supportare la trascrizione da parte della Polimerasi III. In particolare abbiamo definito due nuovi RNA non codificanti, 17A e 51A, lunghi rispettivamente 171 e 423 nucleotidi, e la struttura dei promotori di altri due geni, 38A e 29A. Alcune delle unità trascrizionali caratterizzate (17A, 38A, 51A) sono interne a geni codificanti per proteine in zone dove avvengono fenomeni di splicing alternativo, mentre un’altra (29A) è stata identificata come una Alu. Ulteriori studi sono necessari per caratterizzare più in profondità tali unità trascrizionali in vivo e la funzione dei loro prodotti, in quanto la loro posizione suggerisce un possibile ruolo regolatorio ed una complessità crescente del trascrittoma della Polimerasi III.

The research described in this thesis focused on transcriptional regulation of small nuclear RNA (snRNAs) genes, a group of highly abundant, non-protein-coding transcripts forming the core of the spliceosome, that catalyses the removal of introns from pre-mRNAs. SnRNAs (U1 to U6) are synthesized by RNA Polymerase (Pol) II, with the exception of the U6 snRNA, whose gene is transcribed by Pol III. As compared to the metazoan snRNAs, little is known about snRNA synthesis in unicellular organisms. In the first work described in this thesis we identified putative regulatory elements in yeast Pol II-transcribed snRNA gene promoters, starting from phylogenetic footprinting. The analysis revealed some evolutionarily conserved sequence blocks matching the consensus binding site of known general regulatory factors (Rap1, Abf1, Reb1) and a few regulatory elements known to be involved in different pathways (RRPE - ribosomal RNA processing element; PACE - Proteasome Associated Control Element). To better understand the involvement in transcription of the identified putative promoter elements we prepared sequence-tagged version of two S. cerevisiae snRNA genes, LRS1 (coding for U2 snRNA) and SNR7 (coding for U5 snRNA), to be used as reporter genes for in vivo expression analysis. Mutational analysis of the upstream conserved motifs revealed their influence on snRNA gene transcription, possibly involving the generation or maintenance of nucleosome-free promoter regions. The second part of this thesis focused on the characterization of novel snRNA gene-like transcriptional units in the human genome. By means of computer search for upstream promoter elements (proximal sequence element and distal sequence element) typical of small nuclear RNA genes, we have identified some putative transcription units. We analyzed the in vitro transcription properties in HeLa and SKNBE neuroblastoma cells nuclear extracts of some of these putative units, showing that their promoter elements were actually able to support Pol III-dependent transcription. In particular, we defined the boundary of two novel ncRNAs, 17A and 51A, 171 nt and 423 nt in length respectively and the promoter architectures of two other ncRNA genes, 38A and 29A. Some of the characterized transcriptional units (17A, 38A, 51A) are internal to known protein-coding genes where alternative splicing events takes place, while another (29A) was identified as an Alu. Further studies will be required to better characterize these transcription units in vivo and the function of their products, even though their location suggest a possible regulatory role and an increasing complexity of the pol III transcriptome.