Characterization of non-symbiotic hemoglobins from Arabidopsis thaliana in solution and encapsulated in silica gels

Abstract

L’attività di ricerca svolta durante il corso di Dottorato è stata focalizzata sulla caratterizzazione delle emoglobine AHb1 e AHb2 di Arabidopsis thaliana, tramite l’uso di metodi spettroscopici steady state e risolti nel tempo. Gli spettri UV-visibile delle due emoglobine nello stato deossigenato hanno mostrato che, a differenza di AHb2, AHb1 non è completamente esacoordinata in soluzione. Le cinetiche di legame del monossido di carbonio (CO) ad AHb1 e AHb2 sono state misurate tramite lo stopped flow rapid mixing e la laser flash fotolisi, a differenti condizioni di temperatura e concentrazioni di CO. I risultati hanno messo in evidenza che queste due emoglobine hanno una reattività notevolmente diversa nei confronti dei ligandi esogeni. Le misure di stopped flow hanno confermato la co-esistenza in AHb1 deossigenata della forma pentacoordinata ed esacoordinata dell’eme. L’ampiezza molto piccola della fase geminata osservata tramite flash fotolisi per AHb1 ha suggerito la presenza di un canale relativamente aperto che mette in comunicazione la cavità distale dell’eme con l’esterno. Per AHb2, le fluttuazioni della proteina sono risultate cruciali nell’influenzare la migrazione del ligando dall’eme al solvente, come testimoniato dalla dipendenza dalla temperatura dell’ampia fase di rebinding geminato. È stata osservata per entrambe le emoglobine la possibilità di una competizione per il legame con l’eme tra il CO fotodissociato e l’istidina distale. Sono state inoltre effettuate misure di rebinding del CO a campioni di AHb1 e AHb2 incapsulati in gel di silice e immersi in glicerolo. Il confronto tra le cinetiche misurate per AHb1 e AHb2 in soluzione e incapsulate in gel di silice ha sottolineato i ruoli svolti dalle fluttuazioni della matrice proteica e dalla migrazione del ligando. L’incapsulazione in gel di silice non ha alcun effetto sulle cinetiche di rebinding ad AHb1, mentre causa un notevole aumento dell’ampiezza della fase geminata per AHb2. L’uso del glicerolo produce un consistente allargamento della fase geminata per entrambe le proteine, in particolar modo per AHb1, che presenta un rebinding geminato multifasico, ad evidenza della presenza di più siti di docking in quale il ligando può essere temporaneamente allocato. Le strutture di AHb1 e AHb2, modellate sulla base della struttura dell’emoglobina di riso, così come la struttura cristallografica di AHb2 C75S da noi risolta, mostrano un differente sistema di cavità interne compatibile con le cinetiche di legame osservate. Al fine di mettere in evidenza quale sia il ruolo della coordinazione bis-istidinica dell’eme nel modulare il legame di ligandi esogeni, abbiamo effettuato degli esperimenti sui mutanti di AHb1 sulla HisE7 e sulla PheB10. La mutazione dei residui della cavità distale producono un aumento del legame geminato ed una velocità di legame bimolecolare apparentemente più alta rispetto alla proteina wild type. Inoltre, abbiamo mostrato che AHb1 ha un’elevata reattività verso l’ossigeno ed il monossido di azoto, suoi potenziali ligandi fisiologici. In conclusione, i dati cinetici e strutturali acquisiti supportano l’ipotesi di una attività NO-diossigenasica per AHb1, mentre il ruolo di AHb2 rimane poco chiaro.

The research activity carried out during the PhD course has been focused on the characterization of Arabidopsis thaliana AHb1 and AHb2, by means of steady state and time resolved spectroscopic methods. UV-visible absorption spectra of the two hemoglobins in the deoxygenated state showed that, differently from AHb2, AHb1 is not fully hexacoordinated in solution. CO binding kinetics to AHb1 and AHb2 were measured using stopped flow rapid mixing and nanosecond laser flash photolysis, at different conditions of temperature and CO concentration. The results showed that these two hemoglobins have a remarkably different reactivity towards exogenous ligands. Stopped flow measurements confirmed the co-existence of penta- and hexacoordinated heme in deoxygenated AHb1. The very small geminate rebinding observed by flash photolysis on AHb1 suggested the presence of a relatively open channel connecting the distal heme cavity with the exterior. For AHb2, protein dynamics resulted crucial in affecting the ligand migration from the heme to the solvent, as witnessed by the large, temperature dependent geminate rebinding. The possibility of a competition for heme binding between the photodissociated CO and the distal histidine was observed in both hemoglobins. We also performed CO rebinding measurements on samples of AHb1 and AHb2 encapsulated in silica gels and soaked in glycerol. The comparison between time courses measured on AHb1 and AHb2 in solution and encapsulated in silica gels highlighted the different interplays between protein dynamics and ligand migration. Gel encapsulation had essentially no effect on CO rebinding kinetics to AHb1, while it caused a dramatic increase in the amplitude of the geminate phase for AHb2. The use of glycerol produced a consistent enlargement of the geminate phase for both proteins and, particularly, for AHb1, which presented a multiphasic geminate rebinding, consistent with the existence of discrete docking sites in which ligands can be temporarily allocated. The structures of AHb1 and AHb2, modelled on the basis of the homologous rice hemoglobin, as well as the crystal structure of AHb2 C75S that we have solved, exhibit a different cavity system that is fully compatible with the observed ligand binding kinetics. In order to highlight the role of bis-histidyl heme coordination in modulating ligand binding, we performed experiments on HisE7 and PheB10 mutants of AHb1. The mutation of distal cavity residues produced an increased geminate recombination and a much higher apparent bimolecular rebinding rate with respect to wt protein. Moreover, we showed that AHb1 has a very high reactivity towards O2 and NO, which are believed to be its physiological ligands. Altogheter, the kinetic and structural data acquired support the hypothesis of a NO-dioxygenase activity for AHb1, while the role of AHb2 remains unclear.