Self-processing of the Phospholipase A2 from the Symbiotic Ascomycete Tuber borchii

Abstract

TbSP1 is a secreted phospholipase A2 expressed in the filamentous fungus Tuber borchii and is up-regulated by nutrient starvation. In this study, the occurrence of an autoproteolytic processing, both in vivo and in vitro, is reported for TbSP1. The cleavage takes place at the N-terminus of the protein via an intermolecular mechanism, and generates a fragment with molecular mass of 14.5kDa. Distinct catalytic residues are involved in the two enzymatic activities, since point mutant in the His responsible for phospholipid hydrolysis still retains self-processing ability. TbSP1 autoproteolysis is presumably mediated by a Ser residue, however the precise localization and the structure of the active site are still unknown. The combination of limited proteolysis assays, site-directed mutagenesis and the synthesis of a chimeric Trx construct suggested that both a structural and a sequence motif play a role in the recognition of the cleavage target region. Since the digestion fragment has increased phospholipasic and proteolytic activity, a physiological role has been proposed for the auto-proteolytic event, which thus represents a further step in TbSP1 maturation process.

TbSP1 è una fosfoliapsi A2 secretoria del fungo filamentoso Tuber borchii ed è sovra-espressa in carenze nutrizionali. Nel presente studio, viene descritto il processa mento mediante auto proteolisi di TbSP1, osservato sia in vivo che in vitro. Il taglio proteolitico avviene nella porzione N-terminale della proteina attraverso un meccanismo intermolecolare, e genera un frammento con massa molecolare di 14.5kDa. Poiché il mutante puntiforme nell’istidina responsabile dell’idrolisi dei fosfolipidi mantiene la capacità di auto processarsi, nelle due attività enzimatiche sono coinvolti residui catalitici diversi. L’autoproteolisi di TbSP1 è presumibilmente mediata da un residuo di serina, ma la precisa localizzazione e struttura del sito attivo non sono ancora note. Dalla combinazione di esperimenti di proteolisi limitata, di mutagenesi sito-specifiche e della sintesi di un costrutto chimerico della Trx, è emersa l’importanza di un motivo sia strutturale sia di sequenza nel riconoscimento della regione di taglio. Poiché il frammento ottenuto dalla digestione ha un’incrementata attività fosfolipasica e protesica, è stato proposto un ruolo fisiologico per l’evento autoproteolitico, che rappresenta quindi un ulteriore passaggio nel processo di maturazione di TbSP1.