Struttura e funzione di recettori batterici di luce blu contenenti i domini proteici LOV (Light, Oxygen and Voltage)

Abstract

Le proteine fotorecettrici di luce blu contenenti il dominio fotosensore LOV (Light, Oxygen and Voltage), scoperto per la prima volta nelle fototropine di piante nel 1997, sono presenti in circa il 13 % dei batteri attualmente sequenziati. Sebbene il loro ruolo come fotorecettori sensoriali sia stato dimostrato solo per un ristretto numero di casi, il meccanismo di risposta alla luce e il relativo fotociclo transiente appaiono ben conservati con le fototropine di piante. Le reazioni fotochimiche si incentrano sul cromoforo flavin-mononucleotide (FMN), un derivato della riboflavina. Lo studio di questi fotorecettori di nuova generazione è di grande interesse sia dal punto di vista biologico, per la definizione di un nuovo ed inatteso paradigma di percezione della luce nei procarioti, che dal punto di vista biofisico, poiché molti aspetti strutturali e funzionali rimangono da definire. La questione chiave resta infatti l’elucidazione del meccanismo primario di trasduzione del segnale innescato dalla luce in queste proteine modulari dove il dominio fotosensore è accoppiato a domini effettori di diversa funzionalità. Inoltre rimane in molti casi da dimostrare che il dominio effettore sia effettivamente regolato dal dominio fotosensore LOV, in analogia alle fototropine di piante. Nel presente lavoro sono state studiate struttura e funzione di due proteine LOV batteriche: YtvA da Bacillus subtilis e una LOV-chinasi da Pseudomonas syringae pv. tomato (PST-LOV). YtvA comprende un dominio LOV seguito da un dominio STAS (sulphate transporter anti-sigma factor antagonist); PST-LOV è invece composta da un dominio LOV, una histidine kinase (HK) e un Response Regulator (RR). Per l’aspetto strutturale, abbiamo utilizzato un approccio sperimentale multidisciplinare comprendente cromatografia su gel, analisi di spettri di dicroismo circolare e modellistica computazionale. Per YtvA tale studio ha portato alla realizzazione di un modello di dimero del dominio LOV, di recente verificato con una struttura cristallina. Sono stati altresì proposti due modelli a bassa risoluzione di proteina intera, sia per YtvA che per PST-LOV. Lo studio sulla funzionalità molecolare di YtvA ci ha permesso di determinare che il dominio STAS lega nucleotidi trifosfati (NTP) e che avviene una effettiva trasmissione interdominio del cambiamento conformazionale innescato dal fotociclo del dominio LOV. Tali studi sono stati condotti utilizzando un derivato fluorescente del GTP (marcato con il fluoroforo BODIPY TR 2’-(o-3’)-O-(N-(2-aminoethyl-urethane, abbreviato in GTPTR). Abbiamo inoltre individuato un aminoacido chiave per la trasmissione del segnale LOV-STAS, Glu105: la mutazione E105L infatti sopprime completamente la trasmissione LOV-STAS dei cambiamenti conformazionali fotoindotti al sito di legame per il GTPTR. Lo studio sulla funzionalità di PST-LOV ha portato invece alla dimostrazione del primo meccanismo di risposta al segnale tipo “two component” stimolato dalla luce blu nei batteri: esperimenti con ATP radioattivo hanno infatti dimostrato che l’attività chinasica è stimolata dalla luce blu, tramite l’attivazione del dominio LOV. Inoltre, attraverso l’analisi di diversi costrutti della proteina, abbiamo stabilito che l’accettore finale del fosfato inorganico proveniente dall’ATP legato al dominio chinasico, è il dominio RR, come ci si aspetterebbe da un tipico sistema “two component” batterico.